彭 武 王煒清 王 萍 余雄偉 付琴利 李述剛

(1. 合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2. 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；3. 塔里木大學(xué)，新疆 阿拉爾 843300；4. 武漢旭東食品有限公司，湖北 武漢 430000)

2018年世界核桃總產(chǎn)量為3 662 507 t，中國(guó)的核桃總產(chǎn)量為1 586 367 t[1]，約占世界核桃總產(chǎn)量的1/2。核桃仁中富含維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)，其中約70%的脂質(zhì)為不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸、亞麻酸等[2-5]。食品加工中，由于核桃仁富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一直被作為功能性成分添加到食品中，如肉類(lèi)、乳制品和烘焙類(lèi)食品的加工等[6]。

核桃仁蛋白質(zhì)含18種人體所需的各種必需氨基酸，是一種營(yíng)養(yǎng)均衡的重要植物蛋白質(zhì)資源，其由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等組成[7]。在貯藏過(guò)程中核桃仁蛋白易受到環(huán)境條件(如溫度、光照、氧氣含量等)的影響而造成其品質(zhì)下降，姜莉等[8]研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)核桃仁蛋白的溶解性影響顯著，當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)其溶解性達(dá)到最大；曹燦等[9]研究發(fā)現(xiàn)核桃蛋白在其等電點(diǎn)時(shí)乳化性最小而在堿性環(huán)境中其乳化性較好。

試驗(yàn)擬以核桃仁為研究對(duì)象，通過(guò)圓二色光譜和MALDI-TOF-MS等技術(shù)分析其貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)理化組成、結(jié)構(gòu)特性和消化產(chǎn)物變化規(guī)律，旨在揭示貯藏條件對(duì)核桃仁蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)與功能影響，為其貯藏保鮮與開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃：溫185，新疆阿克蘇地區(qū)；

5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽(DTNB)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)：優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Sigma公司；

二硫蘇糖醇(DTT)：分析純，Aladdin阿拉丁試劑公司；

其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

試驗(yàn)用水均為去離子水；

雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU-1900型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

熒光分光光度計(jì)：F-4600型，日立高新技術(shù)(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司；

圓二色光譜儀：J-1500型，日本Jasco公司；

傅里葉紅外變換光譜儀：Nexus470型，美國(guó)Mettler公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 核桃仁去殼烘干后分為真空包裝和非真空包裝兩種包裝方式，分別于(4.0±0.1)，(35.0±0.1)，(25.0±0.1) ℃ 3種溫度下保存9個(gè)月，貯藏期間提取核桃仁蛋白進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 核桃仁蛋白的提取 參照Liu等[10]的方法略修改。通過(guò)石油醚脫脂并用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗滌得到脫脂核桃粉。將得到的脫脂核桃粉溶解于去離子水[m核桃粉∶V去離子水=1∶20 (g/mL)]中，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至11.0。30 ℃下攪拌3 h，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min。取上清液，用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH至4.5，4 ℃、10 000 r/min離心15 min。用1 mol/L NaOH溶液將沉淀pH調(diào)至7.0，4 ℃透析3 d去除雜質(zhì)和多余試劑，冷凍干燥得到蛋白粉。

1.2.3 SDS-PAGE電泳 將核桃仁蛋白溶液(1 mg/mL)與樣品緩沖液以V核桃仁蛋白∶V緩沖液=1∶1混合。選擇4%的積層凝膠和12%的分離凝膠進(jìn)行電泳。樣品進(jìn)入分離凝膠后，先于70 V下電泳約30 min，然后于100 V下電泳[11]。

1.2.4 二硫鍵和游離巰基含量測(cè)定

(1) 巰基含量：參照Z(yǔ)hao等[12]的方法并略改。取核桃仁蛋白粉0.1 g加入30 mL去離子水，磁力攪拌2 h后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容。移取1 mL蛋白溶液(2 mg/mL)溶解于包含有5 mL尿素溶液(8 mol/L、pH 8.0)的Tris-甘氨酸緩沖液和0.04 mL DTNB溶液(4 mg/mL)中。25 ℃反應(yīng)1 h，測(cè)定412 nm處吸光度。按式(1)計(jì)算游離巰基含量。

(1)

式中：

CSH——游離巰基含量，μmol/g；

A412 nm——蛋白質(zhì)在412 nm處吸光度；

C——樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；

D——稀釋因子。

(2) 二硫鍵含量：取3.0 mL包含有10 mmol/L DTT的尿素溶液(8 mol/L)與1.0 mL的蛋白質(zhì)溶液(2 mg/mL)混勻，25 ℃反應(yīng)1 h。添加6 mL體積分?jǐn)?shù)為12%的三氯乙酸(TCA)反應(yīng)1 h，將得到的蛋白質(zhì)懸液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min。將沉淀加入到9 mL尿素(8 mol/L)溶液和0.09 mL DTNB溶液中?；靹?，測(cè)定412 nm處吸光度。按式(2)計(jì)算二硫鍵含量。

(2)

式中：

CSS——二硫鍵含量，μmol/g；

CSHT——總巰基含量(包括游離SH和還原的SS)，μmol/g；

CSHF——游離巰基含量，μmol/g。

1.2.5 羰基化合物含量測(cè)定 參照Shi等[13]的方法并略改。將1 mL蛋白溶液(2 mg/mL)加入到溶有1 mL DNPH溶液(10 mmol/L)的2 mol/L HCl中，室溫黑暗條件下攪拌1 h。加入3 mL 20%的TCA用來(lái)沉淀蛋白質(zhì)。用1 mL乙醇和乙酸乙酯(V乙醇∶V乙酸乙酯為1∶1)混合物洗滌沉淀物3次，于3 mL鹽酸胍(6 mol/L)中37 ℃下溶解20 min。用不含蛋白的溶液作為空白對(duì)照組，測(cè)定370 nm 處吸光度，按式(3)計(jì)算羰基化合物的濃度。

(3)

式中：

CC——羰基含量，μmol/g；

A370 nm——樣品在370 nm處吸光度；

D——稀釋因子；

C——蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；

ε370 nm——DNPH的摩爾消光系數(shù)，22 000。

1.2.6 圓二色光譜 用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)將蛋白質(zhì)溶液配置為0.2 mg/mL溶液，掃描范圍為190～250 nm。

1.2.7 蛋白質(zhì)溶解度的測(cè)定 參照Qu等[14]的方法并略修改。樣品溶液(10 mg/mL)于室溫下攪拌2 h，8 000 r/min 離心20 min，按式(4)計(jì)算上清液蛋白濃度。

(4)

式中：

S——蛋白質(zhì)溶解度，%；

C1——上清液中蛋白質(zhì)含量，mg/mL；

C2——樣品中蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

1.2.8 表面疏水性(Ho)的測(cè)定 參照Hou等[15]的ANS探針?lè)ú⒙孕薷摹①|(zhì)量濃度為1 mg/mL的核桃仁蛋白溶液分別稀釋至0.001 25，0.002 50，0.005 00，0.010 00，0.020 00 mg/mL。取20 μL ANS溶液(8 mmol/L)加入到4 mL蛋白溶液中混勻。激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm。以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作圖，其斜率即為表面疏水性。

1.2.9 體外消化 參照Orsini等[16]的方法并修改。采用胃蛋白酶對(duì)核桃仁蛋白進(jìn)行消化分解，m胃蛋白酶∶m蛋白質(zhì)為1∶10，將反應(yīng)體系的pH調(diào)至2.0，37 ℃水浴2 h，加入0.1 mol/L的碳酸鈉溶液滅酶，6 000 r/min離心20 min，上清液于4 ℃貯藏。

(1) 水解度(DH)的測(cè)定：參照Chang等[17]的方法并修改。配制40 mg/mL的鄰苯二醛(OPA)試劑(溶于甲醇)，依次加入十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液2.5 mL、四硼酸鈉溶液25 mL、巰基乙醇100 μL，加入去離子水定量至50 mL。取200 μL核桃仁蛋白溶液加入至4 mL OPA試劑中，35 ℃反應(yīng)2 min，測(cè)定340 nm處吸光度，按式(5)計(jì)算水解度。

(5)

式中：

DH——水解度，%；

At——水解樣品的吸光度；

A0——原樣品的吸光度；

M——核桃仁蛋白的平均分子量；

ε——摩爾消光系數(shù)，6 000 (mol·cm)-1；

c——樣品濃度；

N——每個(gè)蛋白質(zhì)分子的平均肽鍵數(shù)。

(2) MALDI-TOF-MS分析：利用MALDI-TOF-MS對(duì)體外消化產(chǎn)物上清液進(jìn)行分析，肽質(zhì)量指紋圖譜參數(shù)設(shè)置：紫外波長(zhǎng)355 nm；加速度電壓20 000 V；最佳質(zhì)量分辨率1 500 Da；重復(fù)頻率200 Hz；采集60～7 000 Da的信號(hào)。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理及分析 所有試驗(yàn)重復(fù)3次，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)分子量分布

由圖1可知，核桃仁蛋白分子量主要分布在35～70，10～15 kDa；且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，分子量位于10～15 kDa 處的蛋白波段逐漸變淺，140 kDa處的波段逐漸加深，表明隨著貯藏時(shí)間的增加，核桃仁蛋白分子聚集度加大；同時(shí)，與非真空條件相比，核桃仁蛋白在真空條件下聚集程度較低，兩種真空條件下，4 ℃的聚集程度均低于25 ℃和35 ℃的。這可能是由于核桃仁蛋白分子在貯藏過(guò)程中結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白質(zhì)內(nèi)部二硫鍵含量發(fā)生變化以及表面電荷的改變使得小分子肽之間發(fā)生聚集，造成蛋白質(zhì)聚集度上升，而在真空或者冷藏條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞的程度較低。

2.2 二硫鍵、游離巰基及羰基化合物含量變化

蛋白質(zhì)游離巰基和二硫鍵含量的變化與蛋白質(zhì)中的活性基團(tuán)特別是半胱氨酸殘基密切相關(guān)，二硫鍵含量越高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更緊密，其表面活性越差。由圖2(a)、圖2(b) 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃仁蛋白的游離巰基含量顯著降低，從38.77 mol/g下降至8.55 mol/g，而二硫鍵含量從16.88 mol/g增加到36.40 mol/g；真空條件下核桃仁蛋白質(zhì)的二硫鍵、游離巰基含量的下降趨勢(shì)緩于非真空條件；兩種真空條件下，4 ℃時(shí)游離巰基含量的下降趨勢(shì)最慢，表明核桃仁蛋白在貯藏過(guò)程中結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出了更多的活性基團(tuán)(主要是疏水基團(tuán)和半胱氨酸)，以及半胱氨酸和蛋氨酸殘基，其極易被氧化。而蛋白質(zhì)中的游離巰基易受羥基自由基的影響，會(huì)被氧化轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)和分子間的二硫鍵[18]，導(dǎo)致二硫鍵含量上升，且真空和冷藏環(huán)境對(duì)于游離巰基的氧化具有抑制作用。

M. 蛋白質(zhì)標(biāo)品 1. 真空條件4 ℃ 2. 真空條件25 ℃ 3. 真空條件35 ℃ 4. 非真空條件4 ℃ 5. 非真空條件25 ℃ 6. 非真空條件35 ℃

蛋白質(zhì)的羰基化是非酶促不可逆反應(yīng)，會(huì)造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的損壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)失去其原有的溶解性、表面疏水性等功能特性。由圖2(c)可知，核桃仁蛋白質(zhì)中羰基化合物含量隨貯藏時(shí)間的增加而增加；35 ℃非真空貯藏9個(gè)月后，核桃仁蛋白質(zhì)的羰基含量從0.11 mol/g 顯著增加到12.91 mol/g (P<0.05)；4 ℃真空貯藏9個(gè)月后，羰基化合物含量變化最小。這可能是由于蛋白質(zhì)的α-碳原子和氨基酸(賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、酪氨酸等)側(cè)鏈易受自由基、脂質(zhì)過(guò)氧化或中間產(chǎn)物的氧化；同時(shí)肽鏈可以通過(guò)斷裂或與非蛋白成分結(jié)合形成羰基，使核桃仁蛋白質(zhì)的羰基化合物含量在貯藏期間增大；而真空冷藏條件不利于羰基化合物的生成。

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

由表1可知，隨著貯藏時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)的β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲度上升，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角減少；真空條件下4 ℃ 時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)最為緩慢，表明隨著貯藏時(shí)間的增加，核桃仁蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，即蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)趨向于無(wú)序松散狀態(tài)，其穩(wěn)定性逐漸降低；真空和冷藏環(huán)境對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化具有減緩作用。

圖2 貯藏條件對(duì)游離巰基、二硫鍵及羰基化合物含量的影響

表1 貯藏條件對(duì)核桃仁蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.4 蛋白質(zhì)功能特性

2.4.1 溶解性 由圖3可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃仁蛋白質(zhì)溶解度顯著降低(P<0.05)。非真空35 ℃時(shí)的溶解度降低得最多，貯藏9個(gè)月后蛋白質(zhì)溶解度由25.63% 降低至3.27%；真空4 ℃時(shí)的溶解度降低得最少，貯藏9個(gè)月后溶解度由25.63%降低至14.55%。溶解度的降低可能與蛋白質(zhì)表面電荷的變化引起疏水作用的增強(qiáng)有關(guān)[19-20]：① 聚集后的蛋白質(zhì)表面電荷分布不均，親水性片段較少，限制了蛋白質(zhì)與水之間相互作用的頻率，促進(jìn)了蛋白質(zhì)顆粒之間的聚集，最終降低了蛋白質(zhì)的溶解性；② 由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞、疏水性基團(tuán)的暴露進(jìn)一步導(dǎo)致了蛋白質(zhì)溶解度的降低，而真空和冷藏條件對(duì)于溶解度的降低具有阻礙作用。

2.4.2 表面疏水性 由圖4可知，核桃仁蛋白質(zhì)的表面疏水性隨貯藏時(shí)間的增加而增加，其中非真空35 ℃下的表面疏水性增加得最多，從4 049.7增長(zhǎng)至9 165.9；真空4 ℃下的表面疏水性增加得最低，由4 049.7增長(zhǎng)至6 573.2。這可能是由于貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，將原本存在于內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面從而增加了蛋白質(zhì)的表面疏水性[21]；且真空和冷藏條件對(duì)于表面疏水性的上升具有阻礙作用。

2.4.3 體外消化特性

(1) 水解度：由圖5可知，真空4 ℃時(shí)的水解度略有下降，而非真空35 ℃時(shí)的水解度下降最為顯著，從47.28% 下降至36.15%；說(shuō)明較高的溫度及非真空條件使得水解度的降低更為明顯。水解度的下降可能是由于蛋白質(zhì)分子的聚集，較高的溫度和非真空環(huán)境會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)分子聚集，降低胃蛋白酶作用位點(diǎn)，抑制胃蛋白酶活性[22]；此外蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)消化程度的改變，例如β-折疊的含量與蛋白質(zhì)體外消化率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[23-24]。

圖3 貯藏條件對(duì)核桃仁蛋白質(zhì)溶解度的影響

圖4 貯藏期間核桃仁蛋白質(zhì)表面疏水性的變化

(2) 消化產(chǎn)物：由圖6可知，核桃仁蛋白質(zhì)體外消化分解產(chǎn)物的初始階段肽段主要集中在1 000～2 000 Da，與4 ℃ 貯藏的樣品相比，非真空35 ℃下的低分子量肽分布較少，高分子量肽分布較多，肽段種類(lèi)較豐富。這是由于核桃仁蛋白質(zhì)分子隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生交聯(lián)并產(chǎn)生聚集，掩蓋了胃蛋白酶的裂解位點(diǎn)，因此核桃仁蛋白質(zhì)聚集物難以被胃蛋白酶降解成小肽段，故核桃仁蛋白質(zhì)消化肽段的分子量逐漸增加。

(3) 維恩圖：由圖7可知，真空條件下核桃仁蛋白質(zhì)消化后鑒定出的獨(dú)特多肽數(shù)分別為13 521，12 343，10 969，10 296；非真空條件下，獨(dú)特肽段分別為13 886，12 377，10 114，5 497。由于消化率越高，其消化產(chǎn)物中獨(dú)特的肽段越多。因此，貯藏方式對(duì)核桃仁蛋白質(zhì)的消化特性影響較大，其中真空4 ℃下核桃仁蛋白質(zhì)的消化率較高。

3 結(jié)論

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，6種貯藏方法下的核桃仁蛋白質(zhì)的品質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能特性均發(fā)生了不同程度的變化，且溫度與真空度對(duì)核桃仁蛋白質(zhì)品質(zhì)具有顯著影響。貯藏期間，核桃仁蛋白質(zhì)的二硫鍵含量和羰基化合物含量顯著上升，游離巰基含量顯著下降；蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在貯藏期間發(fā)生改變：β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲度的比例上升，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的比例下降，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)總體上趨向于無(wú)序松散狀態(tài)，非真空包裝35 ℃下貯藏9個(gè)月后的核桃仁蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化最為明顯，其α-螺旋下降至18.37%，β-折疊上升至32.94%。蛋白質(zhì)功能特性方面：貯藏期間核桃仁蛋白質(zhì)由于其結(jié)構(gòu)的破壞使得疏水性基團(tuán)暴露導(dǎo)致表面疏水性增加，溶解度下降，其中非真空35 ℃下的變化最為明顯，表面疏水性從4 049.7增長(zhǎng)至9 165.9，而溶解度由25.63%降低至3.27%；此外，核桃仁蛋白質(zhì)聚集度的上升與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變掩蓋了胃蛋白酶的作用位點(diǎn)，降低了核桃仁蛋白質(zhì)的消化特性，且真空4 ℃下貯藏的核桃仁蛋白質(zhì)的消化率最好。后續(xù)可探究核桃仁蛋白質(zhì)的品質(zhì)變化機(jī)理及調(diào)控策略方法等，以提高其開(kāi)發(fā)應(yīng)用的廣度和深度。

圖5 核桃仁蛋白質(zhì)的水解程度

圖6 核桃仁蛋白質(zhì)體外消化分解產(chǎn)物分子量分布

圖7 核桃仁蛋白質(zhì)貯藏9個(gè)月后消化產(chǎn)物維恩圖