段朋生 許金釵 陳屹耒 葉大鵬 翁海勇

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，福建 福州 350002；2. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002；3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)、致瀉大腸埃希氏菌(Diarrheagenice.coli, DEC)、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaenteritidis，SE)和福氏志賀菌(Shigellasppflexneri,S.flexneri)等食源性致病菌是引起食品安全問(wèn)題的主要原因[1]。由食源性致病菌所引發(fā)的急性食物中毒常出現(xiàn)惡心、腹痛、腹瀉、發(fā)燒等癥狀，嚴(yán)重者威脅呼吸、循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)，甚至留下后遺癥[2]。因此，及時(shí)快速診斷出食源性致病菌并判別出菌種屬對(duì)食品安全至關(guān)重要。

目前，微生物檢驗(yàn)技術(shù)是食源性致病菌檢測(cè)中最常用的技術(shù)之一。該技術(shù)準(zhǔn)確性高，但操作復(fù)雜、專(zhuān)業(yè)性強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，一般需要7～10 d[3]。近年來(lái)，光譜技術(shù)能獲取豐富的樣本波譜信息，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法在食品微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景[4-6]。劉斌等[7]對(duì)菌株富集培養(yǎng)后，獲取了經(jīng)冷凍干燥制成的菌粉的傅里葉近紅外光譜信息，建立了偏最小二乘法模型，識(shí)別準(zhǔn)確率達(dá)90%。Yoon等[8]利用高光譜成像技術(shù)對(duì)顯色培養(yǎng)基上培養(yǎng)的17種彎曲桿菌亞種和非彎曲桿菌亞種進(jìn)行了鑒別，識(shí)別準(zhǔn)確率達(dá)99.29%，建立了17種菌的光譜庫(kù)，并開(kāi)發(fā)了一種可應(yīng)用于其他瓊脂平板上病原菌的分類(lèi)鑒別方法。Mehrubeoglu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高光譜成像技術(shù)能表征細(xì)菌隨培養(yǎng)時(shí)間而變化的光譜特征，以及實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的鑒別。Seo等[10]發(fā)現(xiàn)，在顯色培養(yǎng)基上應(yīng)用高光譜成像技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)腸炎沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的鑒別。William等[11]研究表明，高光譜成像技術(shù)對(duì)致病因子中含045和0121的分類(lèi)準(zhǔn)確率為98%，而對(duì)致病因子含026、0111、0103和0145的分類(lèi)準(zhǔn)確率為8%～100%。Gu等[12]利用高光譜技術(shù)建立了支持向量機(jī)(SVM)識(shí)別模型，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的準(zhǔn)確率>98%。石吉勇等[13]利用高光譜對(duì)乳酸菌專(zhuān)用培養(yǎng)基上常見(jiàn)的3種致病菌和5種乳酸菌種進(jìn)行了鑒別與計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)為最佳預(yù)處理方法，最小二乘支持向量機(jī)(LS-SVM)為最佳鑒別模型，識(shí)別率為91.88%。上述研究均要求對(duì)致病菌進(jìn)行培養(yǎng)24 h，一定程度上限制了檢測(cè)效率。

研究擬利用高光譜成像技術(shù)獲取通用培養(yǎng)基上培養(yǎng)12，18，24 h的不同培養(yǎng)期5類(lèi)致病菌(金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、致瀉大腸埃希氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌和福氏志賀菌)高光譜圖像，探究其在通用培養(yǎng)基上不同生長(zhǎng)期的圖譜特性，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量法建立通用培養(yǎng)基上的源性致病菌種的識(shí)別模型，旨在為食品中致病菌的快速檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本制備

將菌種放置在無(wú)菌超凈臺(tái)中，活化，用接種環(huán)挑取S.aureus、DEC、SE和S.flexneri至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，超純水1 000 mL，pH 7.0)，挑取LM至李斯特菌增菌液(胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，K2HPO42.5 g，NaCl 5 g，葡萄糖2.5 g，酵母浸粉6 g，超純水1 000 mL，pH 7.0)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將活化后的增菌液按10-1～10-9中的9個(gè)梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)靡埔簶屛≡鼍褐镣ㄓ闷桨迮囵B(yǎng)基上再次培養(yǎng)12，18，24 h。

1.2 食源性致病菌高光譜圖像采集

高光譜成像系統(tǒng)(HIS)主要包括分辨率為1 024×472 pixels的sCMOS相機(jī)、波長(zhǎng)范圍為400～1 000 nm、分辨率為2.8 nm光譜儀、線光源、電控移動(dòng)平臺(tái)、暗箱和控制計(jì)算機(jī)等(圖1)。試驗(yàn)前，開(kāi)機(jī)預(yù)熱20 min。設(shè)定物距、移動(dòng)平臺(tái)的速度和曝光時(shí)間等參數(shù)。經(jīng)反復(fù)測(cè)試，最終確定的曝光時(shí)間為3 ms，物距為320 mm，移動(dòng)平臺(tái)速度為8.38 mm/s。采集樣品的高光譜數(shù)據(jù)前，先掃描反射率為99%標(biāo)準(zhǔn)白板得到全白的標(biāo)定圖像Iwhite；擰上鏡頭蓋，采集全黑的標(biāo)定圖像Idark；并按式(1)計(jì)算校正后的圖像Icorrection。獲取培養(yǎng)至12，18，24 h的5類(lèi)致病菌(每類(lèi)病菌在每個(gè)時(shí)間段各4個(gè)平板)的高光譜圖像I，以期獲得不同生長(zhǎng)期的食源性致病菌波譜信息。對(duì)校正后的高光譜圖像利用ENVI5.1軟件，以單個(gè)菌落為感興趣區(qū)域，并計(jì)算該區(qū)域的平均光譜曲線，以此作為一個(gè)樣本。分別從培養(yǎng)12，18，24 h的培養(yǎng)基上選擇647，799，769個(gè)樣本，其相關(guān)信息見(jiàn)表1。

(1)

1.3 食源性致病菌高光譜數(shù)據(jù)處理

1.3.1 連續(xù)投影算法(SPA) 原始高光譜數(shù)據(jù)信息豐富，但存在數(shù)據(jù)冗余、維度大等問(wèn)題，因此，有必要從高維度的圖譜數(shù)據(jù)中提取出對(duì)食源性致病菌敏感的特征波段。利用SPA提取不同生長(zhǎng)期致病菌敏感波段。SPA從原始的光譜信息中提取共線性最小的特征波長(zhǎng)變量組合，以使輸入數(shù)據(jù)的冗余信息達(dá)到最小[14]。

1.3.2 最小二乘支持向量機(jī)(LS-SVM) 支持向量機(jī)(SVM)是一種流行的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，其是使定義在特征空間上的不同樣本之間的間隔最大化，即尋找最優(yōu)超平面，將不同樣本分割開(kāi)來(lái)，以達(dá)到分類(lèi)和識(shí)別的目的[15-16]。而LS-SVM則是以最小二乘線性系統(tǒng)作為損失函數(shù)，將原有SVM中的不等式約束問(wèn)題轉(zhuǎn)化成等式約束，簡(jiǎn)化計(jì)算的復(fù)雜性，并提高計(jì)算效率[17-18]。

1. 光源 2. 相機(jī) 3. 光譜儀 4. 光源控制器 5. 鏡頭 6. 樣品 7. 電腦 8. 樣品架 9. 移動(dòng)平臺(tái)

表1 樣本統(tǒng)計(jì)

LS-SVM算法求解的目標(biāo)函數(shù)為：

(2)

約束條件為：

yi=ωTφ(x1)+b+ei，

(3)

式中：

ω——權(quán)重；

γ——正則化參數(shù)；

ei——誤差；

xi——輸入的光譜矩陣，代表第i個(gè)樣本；

yi——模型的輸出變量代表，輸出對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽值；

n——樣本數(shù)。

對(duì)式(2)和式(3)進(jìn)行求解，可引入如式(4)的Lagrange函數(shù)：

(4)

其中，αi為L(zhǎng)agrange系數(shù)，求解式(4)的最優(yōu)解，將其轉(zhuǎn)化為求解式(5)，求解線性方程：

(5)

式中：

I——單位矩陣；

m=<φ(xi),φ(xi)>=K(xi,xj),i,j=1,…,n；

ɑ=[ɑ1, ɑ2,…, ɑn]T；

y=[y1,y2, …,yn]T；

(6)

α=A-1(y-bl)。

(7)

對(duì)任意輸入x，可得到LS-SVM判別函數(shù)：

(8)

選取徑向基作為L(zhǎng)S-SVM的核函數(shù)，采用網(wǎng)格搜索算法和交叉驗(yàn)證相結(jié)合方式實(shí)現(xiàn)LS-SVM模型中γ和sig2(σ2)的尋優(yōu)。分類(lèi)過(guò)程中，S.aureus、LM、DEC、SE和S.flexneri的標(biāo)簽分別賦值為1、2、3、4和5。應(yīng)用Kennard-Stone(KS)算法將光譜數(shù)據(jù)按2∶1分成建模集和預(yù)測(cè)集。采用Unscrambler10.1(CAMO AS, Oslo, Norway)、MATLAB R2014a(MathWorks, Inc., Natick, MA, USA)和ENVI5.1(ITT Visual Information Solutions, Bounder, USA)軟件進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜分析

由圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，各類(lèi)菌的反射率值均有所增大。可見(jiàn)光區(qū)域細(xì)菌的反射率值變化比近紅外區(qū)域780～980 nm的變化更為明顯，5類(lèi)菌在400～1 000 nm 的光譜反射率值變化趨勢(shì)相似，但不同種類(lèi)的菌對(duì)不同波長(zhǎng)光的反射能力不同，這與不同菌的內(nèi)部物質(zhì)成分不同有關(guān)[9]，從側(cè)面說(shuō)明了高光譜成像技術(shù)對(duì)食源性致病菌的快速檢測(cè)具有可行性。此外，由于細(xì)菌細(xì)胞中化學(xué)成分的含氫基團(tuán)因不同振動(dòng)方式的合頻和倍頻在近紅外區(qū)域產(chǎn)生的譜帶重疊，也會(huì)引起這些光譜反射率較為接近[19]。因此，無(wú)法僅依賴(lài)某單個(gè)波段的反射率來(lái)實(shí)現(xiàn)微生物種屬的判別，需進(jìn)一步提取更多的波譜特征，以實(shí)現(xiàn)5類(lèi)致病菌種屬的快速判別。

2.2 主成分分析

由圖3可知，5類(lèi)致病菌在培養(yǎng)12，18，24 h的PC1和PC2的累積貢獻(xiàn)率分別為89.9%，96.6%，95.0%，說(shuō)明PC1和PC2能夠解釋原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息。當(dāng)培養(yǎng)至12 h時(shí)，DEC的光譜與其他4類(lèi)菌的光譜差異性已經(jīng)凸顯。當(dāng)培養(yǎng)至18 h時(shí)，5類(lèi)致病菌各自聚成一類(lèi)的趨勢(shì)更加明顯。當(dāng)培養(yǎng)至24 h時(shí)，5類(lèi)致病菌的光譜特性差異性進(jìn)一步增加，重疊部分逐漸減少。

2.3 食源性致病菌敏感波段篩選

由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)至12 h時(shí)，SPA算法選取了13個(gè)敏感波段(421，422，964，425，968，428，425，435，471，978，497，849，462 nm)用于構(gòu)建5類(lèi)致病菌的判別模型，RMSE最小為0.002 4。當(dāng)培養(yǎng)至18 h時(shí)，SPA算法選取了9個(gè)敏感波段(421，422，450，853，505，763，431，649，978 nm)用于構(gòu)建5類(lèi)致病菌的判別模型，RMSE最小為0.001 9。當(dāng)培養(yǎng)至24 h時(shí)，SPA算法選取了24個(gè)敏感波段(421，423，422，425，426，449，443，499，516，555，433，431，458，431，936，445，450，650，437，921，979，978，977，448 nm)用于構(gòu)建5類(lèi)致病菌的判別模型，RMSE最小為0.001 7。綜上，421，422，978 nm在培養(yǎng)12，18，24 h均被選中為敏感波段，并且有些被選中的波段在不同的生長(zhǎng)期非常接近，說(shuō)明這些波段能較好地反映不同生長(zhǎng)期的食源性致病菌的動(dòng)態(tài)信息。

圖2 5類(lèi)致病菌的平均光譜曲線

圖3 5類(lèi)致病菌的主成分分析得分圖

圖4 SPA提取得到的36個(gè)敏感波段反射率的相關(guān)系數(shù)

為了更好地全面獲取不同生長(zhǎng)期食源性致病菌的波譜信息，有必要將培養(yǎng)12，18，24 h的被SPA選中的敏感波段組合起來(lái)，共獲得36個(gè)敏感波段。當(dāng)兩個(gè)波段反射率的相關(guān)系數(shù)>0.95時(shí)，視為高度相關(guān)，可以去除其中一個(gè)。最終，選擇462，498，649，853，979 nm 5個(gè)波段作為不同生長(zhǎng)期食源性致病菌的敏感波段。

2.4 模型的識(shí)別效果分析

基于SPA-CA篩選的462，498，649，853，979 nm 5個(gè)波段反射率建立的LS-SVM模型對(duì)5類(lèi)食源性致病菌的識(shí)別效果如表2所示。由表2可知，革蘭氏陽(yáng)性菌(S.aureus和LM)與革蘭氏陰性菌(DEC、SE和S.flexneri)的總體識(shí)別準(zhǔn)確率分別為99.6%和99.8%，與同屬于革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌的鑒別較容易，這可能是由革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌在細(xì)胞壁中的主要成分肽聚糖和磷壁酸的差異引起的[20-21]。同屬類(lèi)別的細(xì)菌因化學(xué)組分相似，造成譜帶重疊，易引起誤判，如SE和S.flexneri最容易發(fā)生誤判，其中SE被誤判成S.flexneri的概率為11.2%，S.flexneri被誤判成SE的概率為19.9%。總體而言，SPA-CA-LS-SVM模型的總體識(shí)別準(zhǔn)確率為90.9%，說(shuō)明高光譜成像技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法能實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的快速檢測(cè)。

3 結(jié)論

建立了基于高光譜成像技術(shù)的食源性致病菌檢測(cè)方法。結(jié)果表明，5類(lèi)致病菌對(duì)不同波長(zhǎng)光的反射能力不同。連續(xù)投影算法結(jié)合相關(guān)分析篩選出的5個(gè)敏感波段(462，498，649，853，979 nm)反射率可較好地反映5類(lèi)致病菌在不同生長(zhǎng)期的波譜特性?；?個(gè)敏感波段反射率構(gòu)建的連續(xù)投影算法結(jié)合相關(guān)分析—最小二乘支持向量機(jī)模型對(duì)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和致瀉大腸埃希氏菌3類(lèi)致病菌能夠有效地判別，而腸炎沙門(mén)氏菌和福氏志賀菌兩種屬容易被互相誤判，腸炎沙門(mén)氏菌被誤判成福氏志賀菌的概率為11.2%，福氏志賀菌被誤判成腸炎沙門(mén)氏菌的概率為19.9%。最小二乘支持向量機(jī)模型對(duì)5類(lèi)致病菌的總體識(shí)別正確率為90.9%。綜上，基于高光譜成像技術(shù)結(jié)合最小二乘支持向量機(jī)模型能夠很好地對(duì)這5類(lèi)食源性致病菌進(jìn)行識(shí)別。由于食品受微生物的污染時(shí)有可能存在多種致病菌共同存在的情形，后續(xù)將針對(duì)混合菌種進(jìn)行識(shí)別。

表2 SPA-CA-LS-SVM模型的識(shí)別效果