袁 歡 彭莉莎 孫夢瑤 曹清明，2 龍奇志

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)特醫(yī)食品加工湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004)

菱角是菱角科菱角屬一年生浮葉水生植物，主要品種有兩種，即四角菱(TrapaquadrispinosaRoxb.)和二角菱(TrapabispinosaRoxb.)[1]，常分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)的淡水濕地、湖泊、池塘、河流緩流河段[2-3]。菱角的果肉可以食用，其營養(yǎng)價值高。但菱角殼往往作為廢棄物丟棄，不僅造成植物資源的浪費，而且污染環(huán)境。

菱角殼提取物具有多種生物活性，包括抗氧化[4]、降血糖[5-6]、保護(hù)肝臟細(xì)胞[7-8]、抗癌[9]77-78[10-12]等作用。菱角殼的功能作用主要是由于菱角殼中富含酚酸[13]、黃酮類[6, 14]、多糖[15]、皂苷[9]68、甾體[16]和生物堿[1, 17-20]等活性化合物。Malviya等[21]研究了菱角殼水提物抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中酚類、類黃酮和單寧化合物含量分別為63.81 mg GAE/g·DW，21.34 mg RE/g·DW和17.11 mg TE/g ·DW。呂喆等[22]采用微波萃取法從野生菱角皮和菱角仁中提取到甾醇類化合物，并用高效液相色譜法鑒定其為豆甾醇和β-谷甾醇。Kim等[7]測定了菱角殼水提取物和70%乙醇提取物中總黃酮含量分別為(21.00±1.32)，(45.00±1.03) mg CE/g。鞣質(zhì)是菱角殼中的主要酚類化合物。Huang等[6]從歐菱中分離得到?jīng)]食子酸和6個可水解單寧。林秋生[9]72-78從無角菱殼中分離得到?jīng)]食子酸及其二聚體。周光雄等[10]用85%乙醇提取，從菱角殼中分離得到兩個主要成分：1,2,6-三沒食子酰-沒食子酰葡萄糖和1,2,3,6-四沒食子酰-沒食子酰葡萄糖，進(jìn)一步研究表明，這兩種鞣酸類物質(zhì)具有抗腫瘤活性。符少蓮等[23]運用高效液相色譜法對菱角殼乙酸乙酯萃取部分中的鞣質(zhì)類化合物進(jìn)行了測定，1,2,6-三沒食子酰-β-D-葡萄糖和1,2,4,6-四沒食子酰-β-D-葡萄糖含量分別為85.7，244.0 mg/g。

大孔樹脂因其具有多孔性結(jié)構(gòu)，以及表面電性或氫鍵而具有吸附性。利用其對不同成分的選擇性吸附和篩選作用，能夠分離、提純某一種或某一類有機(jī)化合物[24-25]。天然產(chǎn)物化合物制備的前處理時，通常會利用樹脂去除大部分極性和離子物質(zhì)[26-27]，如糖和酸；食品工業(yè)中，為了減少有機(jī)溶劑的使用和設(shè)備能耗，提高分離效率，也需要用到大孔樹脂分離。Pradal等[28]用5種食品級高分子樹脂XAD 2、XAD 4、XAD 7、XAD 1180和XAD 16從菊苣渣中回收多酚，在優(yōu)化的工藝條件下，多酚總回收率提高到50%；白萬明等[29]用AB-8大孔樹脂對橄欖油加工廢液中的橄欖多酚進(jìn)行富集，其多酚能富集到原來的7.93倍，多酚純度達(dá)到56.44%。呂寒等[30]用弱極性樹脂LS-300B11對四角菱50%乙醇提取物進(jìn)行純化，多酚的最終濃度為91.7%。二角菱與四角菱的多酚種類[31]和數(shù)量[32]差別很大，研究擬對95%乙醇提取液的乙酸乙酯萃取液進(jìn)行純化，從7種大孔樹脂中篩選出對菱角殼中多酚吸附性能最好的樹脂，以期為菱角殼的利用及相關(guān)保健食品的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二角菱殼：湖南益陽，曬干，粉碎后于-4 ℃下保存；

無水乙醇：AR級，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氫氧化鈉：AR級，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

鹽酸：AR級，株洲市星空化玻有限責(zé)任公司；

碳酸鈉：AR級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

福林試劑：AR級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

大孔樹脂：D101、AB-8、X-5、D3520、DA201、D1300、NKA-2型，0.30～1.25 mm，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

可見分光光度計：721型，上海菁華科技儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-5205型，上海亞榮生化儀器廠；

低溫循環(huán)真空泵：DLSB-FZ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

電子天平：FA1004N型，上海菁海有限公司；

磁力加熱鍋：ZNCL-DLS190×90型，上海弘懿儀器設(shè)備有限公司；

髙速萬能粉碎機(jī)：LD-Y300A型，上海頂帥電器有限公司；

空氣浴振蕩器：HZQ-C型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；

恒溫磁力攪拌水浴鍋：HCJ-60型，常州市中貝儀器有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：Scientz-10N型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 二角菱殼樣品的制備 取二角菱殼粉末1 kg，按固液比(m殼粉∶V乙醇)為1∶10 (g/mL)用95%乙醇提取40 min，溫度為50 ℃，將殘渣過濾，濾液減壓濃縮。濃縮液按m濃縮液∶V水=1∶13 (g/mL)用純水稀釋，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，濃縮，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇浸膏。乙酸乙酯浸膏凍干，得到凍干樣品固形物29.4 g，按固形物配制成100 mg/mL的樣液備用。

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取25 mg沒食子酸，溶于無水乙醇，定容到25 mL(1 mg/mL)。配制成0.02 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

分別吸取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的0.02 mg/mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，用水補(bǔ)至2 mL，各加入福林試劑0.5 mL，搖動混合后靜置3 min，加入10%的Na2CO3溶液1 mL，使總體積為3.5 mL。經(jīng)70 ℃水浴加熱10 min后，于725 nm下測定吸光度值。以沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為x軸，吸光度值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品總多酚含量的測定 大孔樹脂洗脫過程中樣品需要進(jìn)行總多酚的測定。準(zhǔn)確移取適量待測樣液于10 mL 具塞試管中，用水補(bǔ)至2 mL，加入0.5 mL福林酚試劑，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作，在725 nm下測得吸光度，代入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即可得到大孔樹脂洗脫前、后樣品中的總多酚含量(表示為mg GAE/g)。

1.3.4 大孔樹脂型號的篩選

(1) 大孔樹脂的預(yù)處理：大孔樹脂使用前需經(jīng)過預(yù)處理以將有毒有機(jī)聚合物去除。參照文獻(xiàn)[33]，先用蒸餾水沖洗樹脂，再以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇將樹脂浸泡12 h，然后用蒸餾水沖洗至無乙醇味；分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的氫氧化鈉和體積分?jǐn)?shù)5%的鹽酸依次浸泡3 h，每次浸泡后用蒸餾水洗樹脂至中性，備用。

(2) 7種大孔樹脂的吸附性能比較：準(zhǔn)確稱取7種不同型號大孔樹脂D101、AB-8、X-5、D3520、DA201、D1300、NKA-2各2 g于錐形瓶中(每組3份平行)，加入20 mL固形物質(zhì)量濃度為4 mg/mL的乙酸乙酯部位樣品液，于25 ℃、120 r/min的搖床上振搖使其充分吸附12 h，吸取上清液，測定總酚含量，按照式(1)和式(2)計算7種大孔樹脂的吸附量、吸附率。將上清液倒入試管中，用少量蒸餾水清洗樹脂，過濾，吸干樹脂表面水分后，將樹脂移至錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液20 mL，于相同條件下振蕩12 h，取適量上清液，測定吸光度值，用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出總多酚含量。按照式(3)和式(4)計算大孔樹脂的解吸量和解吸率。

QA=(C0-C1)×V1/m，

(1)

RA=[(C0-C1)/C0]×100%，

(2)

QD=C2×V2/m，

(3)

RD=[C2/(C0-C1)]×100%，

(4)

式中：

QA——吸附量，mg GAE/g；

RA——吸附率，%；

QD——解吸量，mg GAE/g；

RD——解吸率，%；

C0——二角菱殼乙酸乙酯萃取段的初始多酚含量，mg GAE/mL；

C1——吸附后溶液中多酚含量，mg GAE/mL；

C2——解吸后乙醇洗脫液的多酚含量，mg GAE/mL；

V1——使用的樣品液體積，mL；

V2——洗脫溶劑體積，mL；

m——樹脂吸去水分的質(zhì)量，g。

1.3.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附—解吸條件優(yōu)化

(1) 上樣液固形物濃度對大孔樹脂吸附性能的影響：分別稱取5份預(yù)處理好的D101大孔樹脂2 g放入100 mL 錐形瓶中，取乙酸乙酯部位樣品液20 mL，固形物含量分別為2，3，4，5，6 mg/mL，于搖床中(25 ℃、120 r/min)振蕩進(jìn)行吸附試驗，12 h后取上清液，測定樣品中總多酚含量，考察大孔樹脂對多酚的吸附量。

(2) 洗脫溶劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)對大孔樹脂解吸性能的影響：分別稱取5份預(yù)處理好的D101大孔樹脂2 g放入100 mL錐形瓶中，取固形物濃度為5 mg/mL的乙酸乙酯部位樣液20 mL，于搖床中(25 ℃、120 r/min)振蕩進(jìn)行吸附試驗，12 h后除去上清液，大孔樹脂使用蒸餾水清洗至表面無殘留，分別加入20 mL體積分?jǐn)?shù)50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液，于搖床中(25 ℃、120 r/min)振蕩進(jìn)行解吸試驗，12 h后取上清液，測定樣品中總多酚的質(zhì)量濃度，考察大孔樹脂對多酚的解吸量。

1.3.6 大孔樹脂動態(tài)吸附—解吸條件優(yōu)化

(1) 上樣流速對大孔樹脂吸附性能的影響：分別稱取5份預(yù)處理好的D101大孔樹脂10 g裝入玻璃層析柱(1.8 cm×20 cm)中，取固形物濃度為5 mg/mL乙酸乙酯部位35 mL，上樣流速1，2，3，4，5 mL/min進(jìn)行吸附試驗，收集流出液，測定流出液的多酚含量，考察上樣流速對吸附率的影響。

(2) 洗脫流速對大孔樹脂解吸性能的影響：分別稱取5份預(yù)處理好的D101大孔樹脂10 g裝入玻璃層析柱中，取固形物濃度為5 mg/mL的乙酸乙酯部位35 mL，以流速1 mL/min上樣，進(jìn)行吸附試驗；用70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))5 BV(柱體積)，以洗脫流速分別為1，2，3，4，5 mL/min 進(jìn)行洗脫，收集流出液，測定流出液的總酚含量，考察洗脫流速對解吸率的影響。

(3) 洗脫體積對大孔樹脂解吸性能的影響：分別稱取5份預(yù)處理好的D101大孔樹脂10 g裝入玻璃層析柱中，取固形物濃度為5 mg/mL的乙酸乙酯部位35 mL，以1 mL/min 流速上樣，進(jìn)行吸附試驗；70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))以4 mL/min，分別用3，4，5，6，7 BV進(jìn)行洗脫，收集流出液。測定流出液的多酚含量，考察洗脫溶劑體積對解吸率的影響。

1.3.7 最佳工藝的驗證與放大 采用上述試驗優(yōu)化的D101大孔樹脂的吸附—解吸的最佳工藝條件，對二角菱乙酸乙酯萃取液進(jìn)行吸附—解吸的驗證實驗，收集流出液，濃縮，凍干，得到純化的樣品，測定樣品總多酚含量，以多酚含量考察樣品的純度。采用與驗證實驗相同的條件，將D101樹脂總量擴(kuò)大30倍，裝于4.0 cm×50 cm 的層析柱中，上樣量為1 050 mL，收集流出液，濃縮，凍干，得到放大試驗的總多酚含量，考察樣品的純度。

1.3.8 統(tǒng)計分析 每個測定重復(fù)處理3次，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22軟件處理，其中P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=124.05x-0.003 4，R2=0.999 1，在0.001 09～0.005 63 mg/mL范圍內(nèi)吸光度值與沒食子酸質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系。

2.2 樣品總多酚含量

按照1.3.3對樣品中總多酚含量進(jìn)行測定，經(jīng)計算，凍干樣品(固形物)中總酚含量為478 mg GAE/g。配制的100 mg/mL 的固形物樣液中總酚含量為47.8 mg GAE/mL。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 大孔樹脂型號的篩選

表1為7種大孔樹脂對二角菱殼乙酸乙酯部位中多酚靜態(tài)吸附及解吸情況，其中D101、D1300、AB-8、D3520型大孔樹脂對多酚吸附能力較強(qiáng)，DA-201、D101、D1300大孔樹脂的解吸性能較強(qiáng)，但DA-201大孔樹脂的吸附性能較低，D1300大孔樹脂的解吸率較低，綜合考慮，選用D101大孔樹脂作為二角菱殼乙酸乙酯部位多酚純化的材料。

表1 7種大孔樹脂對二角菱殼乙酸乙酯部位中多酚靜態(tài)吸附及解吸?

2.4 D101大孔樹脂靜態(tài)吸附—解吸條件優(yōu)化

2.4.1 上樣液固形物質(zhì)量濃度對大孔樹脂吸附性能的影響 由圖2可知，隨著上樣液固形物質(zhì)量濃度的增加，D101型大孔樹脂對多酚的吸附量先增加后減小，以20 mL 上樣，當(dāng)上樣液固形物質(zhì)量濃度為5 mg/mL時吸附量最大(22.19 mg GAE/g)。原因可能是上樣液固形物質(zhì)量濃度>5 mg/mL時，樣液中的其他物質(zhì)增多，會與多酚物質(zhì)爭奪D101大孔樹脂的活性位點[34]，造成多酚的吸附量下降；上樣固形物質(zhì)量濃度<5 mg/mL時，樣品質(zhì)量濃度被稀釋，多酚含量減少，造成吸附量降低。因此最佳的上樣固形物質(zhì)量濃度為5 mg/mL。

2.4.2 洗脫溶劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)對大孔樹脂解吸性能的影響 由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，動態(tài)解吸量呈先增加后降低的趨勢；以20 mL上樣，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，動態(tài)解吸量最高(22.53 mg GAE/g)。其原因可能為體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇更有利于二角菱殼中總多酚的溶解，增加乙醇體積分?jǐn)?shù)可能會影響二角菱殼乙酸乙酯部位中總多酚和大孔樹脂之間的相互作用[35]。因此選用洗脫溶劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖2 上樣濃度對D101大孔樹脂吸附性能的影響

2.5 大孔樹脂動態(tài)吸附—解吸條件優(yōu)化

2.5.1 上樣流速對大孔樹脂吸附性能的影響 由圖4可知，隨著上樣流速的增大，動態(tài)吸附率逐漸下降；當(dāng)上樣液流速為1 mL/min時，大孔樹脂能夠充分吸附樣品，動態(tài)吸附率高達(dá)98.65%。這可能是因為上樣液流速過快導(dǎo)致上樣液在層析柱中停留的時間較短，不能與大孔樹脂充分地接觸，使得吸附效果不理想[34]。

圖3 洗脫溶劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)對D101大孔樹脂解吸性能的影響

圖4 上樣流速對D101大孔樹脂吸附性能的影響

2.5.2 洗脫流速對大孔樹脂解吸性能的影響 由圖5可知，隨著洗脫流速的增加，動態(tài)解吸率呈先增大后減小的趨勢；當(dāng)洗脫流速為4 mL/min時，動態(tài)解吸率最高(69.00%)。超過4 mL/min后解吸率降低，可能是因為解吸溶劑通過層析柱速度過快，使得解吸溶劑不能與樹脂充分接觸，影響了解吸液對樣品中總多酚的溶解。因此，最佳洗脫流速為4 mL/min。

2.5.3 洗脫溶劑體積對大孔樹脂解吸性能的影響 由圖6 可知，當(dāng)洗脫溶劑體積為5 BV(即60 mL)時，動態(tài)解吸率最高(65.31%)。其原因可能是隨著洗脫溶劑體積的增加，二角菱殼中總多酚被充分洗脫，再增加洗脫溶劑的體積，解吸能力下降，在實際生產(chǎn)過程中可能會增加生產(chǎn)成本[36]。因此，選擇洗脫溶劑體積為5 BV。

2.6 最佳工藝的驗證與放大

采用優(yōu)化的試驗條件進(jìn)行驗證實驗，其條件為樣液固形物質(zhì)量濃度5 mg/mL，上樣流速1 mL/min，以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液為洗脫劑，用4 mL/min的洗脫流速，洗脫5 BV(柱體積)；將上樣量放大30倍，其他條件不變，進(jìn)行放大試驗。驗證實驗和放大試驗前后，多酚的純化結(jié)果見表2。該條件下多酚含量由478.14 mg GAE/g，純化到825.21 mg GAE/g，提高了1.73倍。放大試驗條件下，純化效果相當(dāng)。

圖5 洗脫流速對D101大孔樹脂解吸性能的影響

圖6 洗脫溶劑體積對大孔樹脂解吸性能的影響

表2 驗證實驗和放大試驗結(jié)果

3 結(jié)論

試驗選用成本相對較低的一些大孔樹脂來純化菱角多酚，通過比較研究，篩選出最優(yōu)的大孔樹脂為D101型大孔樹脂，對D101大孔樹脂純化二角菱乙酸乙酯萃取液中的總多酚條件進(jìn)行優(yōu)化，在最佳工藝條件下，多酚含量由478 mg GAE/g上升到825 mg GAE/g，提高了1.73倍，因此，D101大孔樹脂對二角菱殼乙酸乙酯萃取液中的總多酚有較好的純化效果。該方法操作簡單，成本低廉且效果好，具備推廣應(yīng)用潛力。