陳拾旸 劉風英 陳會民 陳歷俊 陳樹興

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 洛陽市種子管理站，河南 洛陽 471002；3. 洛陽市農(nóng)產(chǎn)品檢測安全檢測中心，河南 洛陽 471002；4. 國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心，北京 100163；5. 北京市乳品工程技術(shù)研究中心，北京 100163)

人體腸道內(nèi)眾多的微生物菌群能夠通過多種途徑影響其他人體器官的功能，從而影響人體的健康狀況，其變化與肥胖、糖尿病、心血管類疾病等密切相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，不僅益生菌本身，其代謝產(chǎn)物的抗病毒能力[2-3]及在食品加工中的應(yīng)用[4]也都具有較大的科學價值。作為人和動物腸道益生菌群的重要組成部分，雙歧桿菌不僅具有抗腫瘤、延緩人體衰老等生理功能[5]，而且還能夠抑制炎癥細胞因子表達、參與抗生素的生物合成等[6-7]。

脂肪酸是生物體的代謝產(chǎn)物成分之一，是其不可缺少的能量和營養(yǎng)物質(zhì)。其中，飽和脂肪酸(SFA)對人體有提供能量、抑制腫瘤病毒生長等功能[8-10]；不飽和脂肪酸中的單不飽和脂肪酸(MUFA)具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂[11]和保護心血管[12]等作用，多不飽和脂肪酸(PUFA)具有維護神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)、預防心腦血管疾病和對抗肥胖等生理功能[13-15]。

不同的微生物具有其獨特的脂肪酸譜，研究[16]證明，細菌脂肪酸譜分析可以作為一種快速的細菌鑒定技術(shù)。Shim等[17]對9株細菌的細胞脂肪酸進行了分析，認為通過細菌細胞脂肪酸鑒定細菌是一種可靠的方法。Ines等[18]通過氣相色譜—真空紫外分光度法分析測定了細胞脂肪酸構(gòu)成，通過主成分分析和聚類分析后，根據(jù)其脂肪酸譜成功對27種細菌進行了分類。

目前，國內(nèi)外對雙歧桿菌的研究多集中在胞外多糖及蛋白特性[19-20]等方面，少數(shù)研究了雙歧桿菌胞內(nèi)脂肪酸的構(gòu)成[21]，而對其代謝產(chǎn)物中脂肪酸構(gòu)成的研究未見報道。試驗擬研究不同雙歧桿菌代謝產(chǎn)物及細胞中脂肪酸的構(gòu)成，以期為后續(xù)雙歧桿菌功能和營養(yǎng)方面的研究及其脂肪酸指紋圖譜的建立提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

假小鏈雙歧桿菌BP-1(BifidobacteriumpseudocatenulatumBP-1)、長雙歧桿菌BL-3(B.longumBL-3)、動物雙歧桿菌BA-5(B.animalisBA-5)、嬰兒雙歧桿菌BI-38(B.infantisBI-38)：實驗室保存菌株；

動物雙歧桿菌A6(B.animalissubsp.LactisA6)：中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)學院教育部—北京市共建功能乳品重點實驗室保存菌株；

雙歧桿菌BS培養(yǎng)基(不含瓊脂)：青島海博生物技術(shù)有限公司；

37種脂肪酸甲酯混標：色譜純，美國Sigma公司；

正己烷：色譜純，西隴化工股份有限公司；

乙酸、乳酸、硫酸、氫氧化鈉、甲醇：分析純，天津市德恩化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：TSQ9000型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

氣相色譜儀：7890A型，安捷倫科技(中國)有限公司；

干式氮吹儀：YY-N100型，上海允延儀器有限公司；

超凈工作臺：BBS-SDC型，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：TYAIB型，寧波久興醫(yī)療器械有限公司；

真空冷凍干燥機：LGJ-10D型，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；

臺式高速冷凍離心機：H1850R型，湖南湘儀離心機有限公司；

分析天平：ATY124型，日本島津有限公司。

1.3 雙歧桿菌的代謝產(chǎn)物樣品及細胞樣品的制備

從保藏菌株的甘油管中按體積分數(shù)2%的接種量分別轉(zhuǎn)接5株雙歧桿菌于200 mL雙歧桿菌BS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，繼代培養(yǎng)3次。將所得菌液在4 ℃ 下以8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾去除菌體后轉(zhuǎn)移至離心管中，作為代謝產(chǎn)物樣品于4 ℃ 下保存?zhèn)溆?；在菌體沉淀中加入5 mL 0.9%生理鹽水，用移液槍抽吸數(shù)次使菌液呈均勻渾濁狀態(tài)，4 ℃，8 000 r/min 離心5 min，重復以上清洗3次，收集菌體后真空冷凍干燥得到各雙歧桿菌菌粉，即細胞樣品。

1.4 雙歧桿菌的代謝產(chǎn)物中乙酸、乳酸含量的測定

根據(jù)許強等[22]的方法。

1.5 雙歧桿菌的代謝產(chǎn)物及菌體中脂肪酸的測定

1.5.1 脂肪酸甲酯化 根據(jù)徐敏等[23]的方法，略作修改。準確量取3 mL代謝產(chǎn)物樣品置于10 mL具塞比色管中，加入2 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液2 mL，混勻后于70 ℃水浴加熱10 min；取出比色管，冷卻至室溫后加入3 mL 正己烷，混勻后萃取，靜置分層后，用移液槍吸取正己烷至10 mL離心管中，氮氣吹干后加入體積分數(shù)10%的硫酸甲醇溶液2 mL進行甲酯化處理，反應(yīng)溫度為70 ℃，時間為15 min；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入1.5 mL 正己烷混勻，靜置分層后，取1 mL正己烷相(上層清液)經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾到進樣瓶中，密封后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

同樣準確稱取50 mg各雙歧桿菌細胞樣品至10 mL具塞比色管中，進行上述相同處理得到甲酯化的細胞脂肪酸樣品備用。

1.5.2 色譜和質(zhì)譜條件 根據(jù)仲玉備等[24]的方法，修改如下：

(1) 色譜條件：采用SP-2560 毛細管柱(100 m×0.25 mm，0.20 μm)；升溫程序：100 ℃保持12 min，以20 ℃/min 升至150 ℃；以2.5 ℃/min升至180 ℃；以0.8 ℃/min 升至196 ℃，保持10 min；以2 ℃/min升至220 ℃；以10 ℃/min升至240 ℃，保持6 min；載氣(Ar)流速1.2 mL/min，進樣口溫度220 ℃；進樣量1 μL；分流比10∶1。

(2) 質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z35～400。

1.5.3 37種脂肪酸定性定量測定 將37種脂肪酸甲酯混標標品分別以稀釋10，20，50，80，100倍進樣1 μL，通過計算得到各脂肪酸的標準曲線。

各個樣品采用同樣條件進樣，定性方法采用與37種脂肪酸甲酯混標的保留時間比對和NIST譜庫檢索；定量方法采用標準曲線法計算得到各樣品的脂肪酸含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗做3次平行，所有試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示。試驗數(shù)據(jù)采用DPS軟件進行差異顯著性分析，差異顯著性水準選用0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 37種脂肪酸甲酯混標的GC-MS分析

圖1為稀釋10倍進樣得到的37種脂肪酸甲酯混標總離子色譜圖。由圖1可知，各組分分離狀況良好，已達到對脂肪酸進行定性及定量分析的要求。

2.2 5株雙歧桿菌代謝產(chǎn)物中乙酸、乳酸的濃度

乙酸、乳酸濃度比值是否大于1，是判斷其是否為雙歧桿菌有機酸代謝產(chǎn)物的標準[25]。5株雙歧桿菌代謝產(chǎn)物中乙酸和乳酸的濃度如表1所示。其中乙酸濃度為28.325～29.430 mmol/L，各菌株之間差異顯著(P<0.05)；乳酸濃度為12.825～13.765 mmol/L，在菌株BL-3、BI-38之間差異不顯著，但均顯著低于其他3組(P<0.05)。另外，各雙歧桿菌代謝產(chǎn)物中乙酸濃度均大于乳酸濃度，與田芬等[26]的研究結(jié)果相一致，且乙酸和乳酸的濃度比為2.085～2.295。研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌產(chǎn)生的乙酸和乳酸，不僅是其主要抑菌代謝物[27]，而且還能夠增強人體抗病毒免疫能力[28]，所以，雙歧桿菌代謝產(chǎn)物中高濃度的乙酸和乳酸對其起抑菌能力及抗病毒免疫能力的評價或許具有重要參考作用。

表1 5株雙歧桿菌代謝產(chǎn)物中乙酸、乳酸的濃度?

2.3 5株雙歧桿菌代謝產(chǎn)物中的脂肪酸構(gòu)成

5株雙歧桿菌代謝產(chǎn)物中的脂肪酸檢測結(jié)果如表2所示。長鏈飽和脂肪酸(LCSFA)中的C16:0、C18:0和C24:0質(zhì)量濃度均較高，3種脂肪酸之和占總脂肪酸質(zhì)量濃度的81.67%～83.54%，為各雙歧桿菌代謝產(chǎn)物中主要脂肪酸，且3種脂肪酸質(zhì)量濃度在A6與BA-5組間差異顯著(P<0.05)；另外，C16:0在5組組間差異顯著(P<0.05)，5組中C16:0與C18:0的質(zhì)量濃度比值為2.607～3.120。短鏈飽和脂肪酸(SCSFA)中，丁酸(C4:0)質(zhì)量濃度在各菌株代謝產(chǎn)物中均較高，其在人體中具有提供能量、修復腸黏膜，改善腸道消化及屏障等功能[29-30]。中鏈飽和脂肪酸(MCSFA)C6:0、C8:0、C10:0、C11:0、C12:0質(zhì)量濃度在各組間無顯著差異。各菌株代謝產(chǎn)物PUFA中，亞油酸(C18:2n-6c)質(zhì)量濃度均較高，研究[31]發(fā)現(xiàn)，人體膳食補充亞油酸有助于改善心衰；另外，總PUFA和總MUFA質(zhì)量濃度在菌株BP-1代謝產(chǎn)物中均最高，且均顯著高于BL-3、BA-5和BI-38(P<0.05)，而在A6中最低。此外，共有19種脂肪酸在質(zhì)量濃度上均有至少2組組間差異顯著(P<0.05)，且LCSFA、MUFA和PUFA總質(zhì)量濃度均有3組組間差異顯著(P<0.05)。因此，不同雙歧桿菌脂肪酸質(zhì)量濃度在代謝產(chǎn)物之間差異較為明顯，且同種不同源的雙歧桿菌菌株之間(動物雙歧桿菌A6和BA-5)也存在著一定的脂肪酸差異。

已有學者[32]證明，健康的代謝與家族壽命息息相關(guān)，因此，具有諸多益生作用的雙歧桿菌，其代謝也與腸道的健康有著密不可分的關(guān)系。Yaron等[33]發(fā)現(xiàn)，富含高β-棕櫚酸酯的奶粉顯著增加了嬰兒腸道中雙歧桿菌的數(shù)量，從而對嬰兒腸道微生物區(qū)系產(chǎn)生有利的影響。試驗中各雙歧桿菌代謝產(chǎn)物中棕櫚酸質(zhì)量濃度都比較高，有可能作為其調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系功能的評價指標之一。

2.4 5株雙歧桿菌細胞中的脂肪酸構(gòu)成

5株雙歧桿菌細胞中的脂肪酸檢測結(jié)果如表3所示。

表2 5株雙歧桿菌代謝產(chǎn)物中脂肪酸測定結(jié)果?

LCSFA是各菌株細胞中主要脂肪酸，其中又以C16:0、C18:0、C24:0占比較大，為各菌株細胞主要脂肪酸，與Veerkamp[21]研究結(jié)果相似。SCSFA中C4:0含量在各組間無顯著差異。MCSFA如C12:0與食用植物精油聯(lián)用可消除食源性病原體，從而可顯著提高食品的微生物安全性[34]，試驗發(fā)現(xiàn)C12:0在長雙歧桿菌BL-3細胞中含量最高，且顯著高于菌株A6、BP-1，因此，長雙歧桿菌BL-3在提高食品安全性方面具有一定的參考價值。MUFA在菌株BL-3中的總含量與BA-5、A6、BP-1無顯著差異，但顯著高于BI-38(P<0.05)。總PUFA含量在各組間無顯著差異。與代謝產(chǎn)物相比，各菌株細胞中未檢測出芥酸(C22:1n-9)、二十四碳烯酸(C24:1n-14)、二十碳五烯酸(C20:5n-3)。另外，在各菌株細胞中，共有11種脂肪酸在含量上均有至少2組組間差異顯著(P<0.05)，且僅有MUFA在BL-3、BA-5中的總含量顯著高于BI-38(P<0.05)。因此，細胞之間不同雙歧桿菌脂肪酸含量有一定差異，相比較于代謝產(chǎn)物中的脂肪酸含量，各菌株細胞內(nèi)的脂肪酸含量更低，其間的差異更小。

表3 5株雙歧桿菌細胞中脂肪酸測定結(jié)果?

細菌細胞內(nèi)脂肪酸主要存在于細胞壁上，其脂肪酸種類和含量比例具有細菌種屬遺傳穩(wěn)定性，可作為鑒定細菌種類的特征標記[35]。雙歧桿菌細胞脂肪酸的構(gòu)成不僅與其抗凍性有關(guān)[36]，而且還能提高其在有機發(fā)酵乳中的存活率[37]。通常情況下，細菌的生長條件也會影響其脂肪酸的構(gòu)成，所以使用完全相同的培養(yǎng)條件來培養(yǎng)生物體有時甚至更為重要[38]。因此，要想通過分析細菌細胞脂肪酸以達到對其進行分類鑒定的目的，除了在保持完全相同的生長條件下及參考脂肪酸種類和含量上的比例之外，還應(yīng)從多角度和多方向上對其進行多元統(tǒng)計分析，最終才能形成更為科學的理論支撐。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)不同雙歧桿菌脂肪酸含量在代謝產(chǎn)物之間差異較為明顯，在細胞之間有一定的差異，同種不同源的雙歧桿菌菌株之間(動物雙歧桿菌A6和BA-5)也存在著一定的脂肪酸差異，且各雙歧桿菌細胞內(nèi)的脂肪酸含量比代謝產(chǎn)物中更低，其間的差異更小。棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、二十四烷酸(C24:0)為5株雙歧桿菌代謝產(chǎn)物及細胞中的主要脂肪酸；各菌株代謝產(chǎn)物中，C16:0在5組組間差異顯著(P<0.05)，C16:0與C18:0的質(zhì)量濃度比(ρC16:0∶ρC18:0)為2.607～3.120、乙酸和乳酸的濃度比(C乙酸∶C乳酸)為2.085～2.295。另外，與代謝產(chǎn)物相比，各菌株細胞中未檢測出芥酸(C22:1n-9)、二十四碳烯酸(C24:1n-14)、二十碳五烯酸(C20:5n-3)。后續(xù)可對雙歧桿菌脂肪酸指紋圖譜的構(gòu)建作進一步研究。