馬秋平 王 輝 涂宗財,2,3 溫平威 胡月明

(1. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西 南昌 330047；2. 江西師范大學(xué)國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；3. 江西師范大學(xué)江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330022)

食物過敏可引起免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)，當(dāng)人體攝入食物過敏原后會引發(fā)一系列臨床癥狀，包括皮膚、胃腸道和呼吸道[1]。據(jù)報道[2]，全球兒童和成人的食物過敏患病率分別約為7.5%和5.0%。牛奶是八大主要過敏原之一，牛奶過敏主要是IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，主要是由牛奶中存在的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)引起的[3]。研究[4]表明，超聲波輔助糖基化改性是一種較為有效的降敏方法。它利用超聲波的熱效應(yīng)、機械剪切力、空化作用、聲沖流等力的協(xié)同作用[5]，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使還原糖能在溫和、短時間內(nèi)對蛋白質(zhì)進行專一性修飾，生成結(jié)構(gòu)明確的蛋白質(zhì)修飾產(chǎn)物，可以避免劇烈條件下的糖基化反應(yīng)導(dǎo)致副產(chǎn)物眾多以及產(chǎn)生對健康不利的產(chǎn)物，是一種新型的食品蛋白質(zhì)糖基化修飾技術(shù)[6-7]。

課題組[8-9]利用超聲波輔助糖基化技術(shù)先后將核糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖等連接到卵清蛋白(OVA)、β-Lg、乳白蛋白(α-La)等蛋白上，顯著降低了被修飾蛋白的致敏性。毛積華等[10]研究了不同己糖(果糖、葡萄糖、半乳糖)對OVA的糖基化修飾效應(yīng)，其中半乳糖修飾的OVA糖基化程度最高，其致敏性最低。Zhong等[11]研究表明超聲波可以通過改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進而顯著提高糖化程度并增加牛血清蛋白的糖化位點，掩蓋抗原表位從而降低其致敏性。Liu等[12]采用超聲波輔助核糖糖基化修飾β-Lg，其致敏性下降了61.54%。然而，超聲波輔助糖基化修飾的蛋白質(zhì)進入人體后，需要經(jīng)過胃和腸消化后才能被人體吸收，而蛋白質(zhì)在整個消化過程中，胃蛋白酶和胰蛋白酶會通過酶切作用破壞其結(jié)構(gòu)，可能會使消化產(chǎn)物的致敏性發(fā)生改變。

基于超聲波輔助糖基化對β-Lg降敏的條件[12]，試驗擬以β-Lg和乳糖(lactase)為原料，采用間接競爭ELISA法研究超聲波結(jié)合糖基化修飾β-Lg在體外模擬消化過程中致敏性的變化，以水解度(DH)分析其消化特性，利用掃描電鏡和動態(tài)光散射、熒光光譜等技術(shù)分析消化產(chǎn)物形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，以期科學(xué)評價超聲波輔助糖基化修飾對蛋白質(zhì)在消化過程中致敏性變化的影響，推動該技術(shù)在工業(yè)上的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

β-乳球蛋白(β-Lg)：> 90%，美國Aldrich-sigma公司；

α-乳糖(≥ 98%)、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

胃蛋白酶(2 500 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)：北京索萊寶科技有限公司；

兔抗牛乳IgG一抗、羊抗兔IgG-HRP、羊抗人IgE-HRP：美國Biocheck Inc公司；

牛乳過敏患者IgE血清：美國Plasmalab International公司；

試驗用水皆為蒸餾水；

其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 過敏患者血清池 IgE血清池由4個牛乳過敏患者的血清(P1～P4)組成，其基本信息見表1。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

超聲波細胞破碎儀：JY92-ⅡN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

粒度儀：Nano ZS90型，英國馬爾文儀器有限公司；

表1 牛奶過敏患者信息

掃描電鏡：Regulus 8100型，日本日立高新技術(shù)公司；

熒光分光光度計：F-7000型，日本日立高新技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 參照文獻[12]。用超純水溶解β-Lg樣品成2 mg/mL，使用超聲波細胞破碎儀以300 W處理15 min。以mβ-Lg∶m乳糖為1∶1混勻后凍干，相對濕度79%，55 ℃孵育4 h，冰浴終止，透析，凍干得糖基化樣品，記作β-Lg-Lac-300，天然的β-Lg為對照品記作β-Lg-N。測得β-Lg-Lac-300樣品的糖基化程度達52.14%。

1.2.2 模擬人體外胃腸消化 參照Minekus等[13]的方法稍作修改，將樣品和胃蛋白酶添加到胃消化液(SGF)中，兩者添加量分別為2 mg/mL和2 000 U/mL。調(diào)節(jié)溶液pH至3.0。在SGF中消化60 min后，使用模擬腸消化液(SIF)消化樣品，樣品和胰蛋白酶的添加量分別為1 mg/mL 和100 U/mL。分別在胃、腸消化0，15，30，60，90，120 min后取出1 mL，調(diào)節(jié)溶液pH至6.5以終止胃消化，添加4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽使終濃度為4 mmol/L 以終止腸消化。所有樣品均于-20 ℃貯藏，并在一周內(nèi)使用。樣品β-Lg-N、β-Lg-Lac-300經(jīng)SGF消化60 min分別記為β-Lg-N-G、β-Lg-Lac-300-G；再經(jīng)SGF消化60 min分別記為β-Lg-N-GI、β-Lg-Lac-300-GI。

1.2.3 消化率測定 采用鄰苯二甲醛(OPA)的方法[14]。以賴氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL，于340 nm處測定吸光度。按式(1)計算消化率。

(1)

式中：

DH——消化率，%；

h——水解后每克蛋白質(zhì)裂解的肽鍵數(shù)；

htot——每克蛋白質(zhì)的肽鍵數(shù)；

A0——未消化樣品的吸光度值；

A1——消化樣品的吸光度值；

K——賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

MW——賴氨酸的分子量，g/mol；

b——樣品質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.4 IgG/IgE結(jié)合能力測定 采用間接競爭ELISA評估所有樣品的IgG/IgE結(jié)合能力，結(jié)合能力越低致敏性越低。96孔板用100 μL質(zhì)量濃度為4 μg/mL的β-Lg溶液包被，37 ℃孵育1 h；加入250 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%魚明膠溶液封閉1 h；加入50 μL質(zhì)量濃度為32 μg/mL待測樣品，再加入50 μL IgG血清(VIgG∶V血清=1∶320 000)或者人血清(稀釋至V人血清∶V水為1∶32)，孵育1 h；加入100 μL IgG-HR或IgE-HRP(VIgG∶VHRP=1∶5 000)二抗，孵育1 h；加入100 μL TMB染色液，孵育15 min，加入50 μL硫酸(2 mol/L)終止反應(yīng)。于450 nm下測量樣品吸光度。按式(2)計算IgG/IgE結(jié)合能力

(2)

式中：

B——IgG/IgE結(jié)合能力，%；

A——待測樣品的吸光度值；

A0——用樣品稀釋液代替樣品的吸光度值。

1.2.5 掃描電鏡 輕鋪一層樣品于導(dǎo)電片上，噴金后置于掃描電鏡下進行形貌表征。加速電壓5 000 V，發(fā)射電流9.6 μA。

1.2.6 粒徑測定 參照Pinto等[15]的方法，將消化后的樣品稀釋成0.25 mg/mL，采用馬爾文激光粒度儀檢測其粒徑。樣品于20 ℃平衡2 min，每個樣品掃描3次取平均值。

1.2.7 電位分析 將消化后的樣品稀釋成0.25 mg/mL，散射角90°，平衡時間120 s，測試溫度25 ℃，連續(xù)測試3次取平均值。

1.2.8 熒光光譜測定 使用熒光光譜儀測量樣品的本征熒光強度，樣品濃度為0.4 mg/mL。內(nèi)源熒光：激發(fā)波長280 nm，掃描速度1 200 nm/min，掃描范圍，300～420 nm。同步熒光：激發(fā)與發(fā)射波長間隔Δλ分別為15，60 nm，其他條件同同步熒光[10]。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值+標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 23.0、Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助糖基化對β-Lg消化率的影響

由圖1可知，胃消化階段，β-Lg-Lac-300的消化率低于β-Lg-N的，隨著消化時間的延長，β-Lg-N的消化率增加較β-Lg-Lac-300快；胃消化60 min后，β-Lg-N的消化率仍增加，而β-Lg-Lac-300的消化率趨于穩(wěn)定，表明超聲波輔助糖基化顯著降低了胃消化率。腸消化階段，腸消化60 min后，β-Lg-N達到消化終點，消化率為68.81%，而β-Lg-Lac-300在60 min時的消化率為48.29%，120 min 時的達到59.85%，表明超聲輔助糖基化減慢了β-Lg的腸消化速率。這可能是因為胃蛋白酶優(yōu)先作用于苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基，而這些氨基酸殘基不能被糖基化修飾[16]。但糖基化對賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)殘基的修飾，阻斷了胰蛋白酶的作用位點[17]。同時，糖基化會降低酪蛋白、乳球蛋白、鱈魚小清蛋白等蛋白的消化率[15,18]。

2.2 IgG/IgE結(jié)合能力

由圖2可知，IgG/IgE結(jié)合能力隨消化時間的延長而降低，且β-Lg-Lac-300的IgG/IgE結(jié)合能力顯著低于β-Lg-N 的，二者在腸消化階段降低較胃消化階段的快；胃消化60 min后，β-Lg-N和β-Lg-Lac-300的IgG/IgE結(jié)合能力分別降為10.23%，8.31%；腸消化60 min后，β-Lg-N和β-Lg-Lac-300的IgG/IgE結(jié)合能力分別降為42.09%，32.09%，說明超聲波輔助糖基化可有效降低β-Lg在消化過程中的致敏性。糖基化可通過掩蓋或破壞蛋白質(zhì)分子的過敏表位來降低其致敏性[19]，參與胃腸道消化的胃蛋白酶和胰蛋白酶則通過酶切作用破壞蛋白質(zhì)的過敏表位，與文獻[20]的結(jié)論相似。

2.3 掃描電鏡

由圖3可知，天然的β-Lg為平整的片狀顆粒，有裂紋；經(jīng)超聲糖基化修飾后變得光滑而致密，裂紋消失，這可能是因為糖基化反應(yīng)使蛋白表面被乳糖覆蓋。而胃消化后，β-Lg-N表面出現(xiàn)大的孔洞，結(jié)構(gòu)變得松散；經(jīng)腸消化后進一步分解成顆粒和纖維絮狀，但結(jié)構(gòu)變得密集。而β-Lg-Lac-300經(jīng)胃消化后形成的顆粒狀結(jié)構(gòu)大于β-Lg-N 的，表面未出現(xiàn)大的孔洞；經(jīng)腸消化后表面出現(xiàn)孔洞，顆粒狀結(jié)構(gòu)仍大于β-Lg-N的，說明超聲波輔助糖基化誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集增加了β-Lg的胃腸消化抗性，與致敏性的降低有關(guān)，與Corzo-Martínez等[21]的結(jié)果相似。而糖基化過程中導(dǎo)致的構(gòu)象破壞，可增加蛋白質(zhì)的水解作用，這種明顯的差異可能與蛋白種類和糖基化反應(yīng)的程度有關(guān)[22]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖3 β-Lg-N和β-Lg-Lac-300消化產(chǎn)物的掃描電鏡圖

2.4 粒徑和ζ-電位

由表2可知，經(jīng)超聲糖基化處理后，β-Lg的平均直徑從533 nm增加到578 nm，粒徑分布系數(shù)增大，但其電位絕對值減??；證明超聲糖基化處理改變了β-Lg的結(jié)構(gòu)，降低了其分散性，這可能與糖基化導(dǎo)致的β-Lg結(jié)構(gòu)的卷曲有關(guān)[15]。經(jīng)胃腸消化后，β-Lg和β-Lg-Lac-300的直徑均先減小后增大，β-Lg-Lac-300的胃消化產(chǎn)物粒子直徑大于β-Lg-N的；腸消化后β-Lg-Lac-300粒子直徑異常增大，PDI達到0.928；而β-Lg-Lac-300的電位絕對值均小于β-Lg-N的。綜上，胃消化后的產(chǎn)物經(jīng)腸消化后發(fā)生聚集，超聲糖基化對蛋白水解作用的抑制使β-Lg-Lac-300以更大的粒徑存在，分散性變差，可能是因為腸消化液的弱堿性環(huán)境，誘導(dǎo)這些帶正電荷的碎片與周圍帶負電荷的環(huán)境發(fā)生非共價鍵聚合[23]。且糖基化增加了粒子之間的靜電引力，蛋白質(zhì)分子間靜電引力的增加會減弱粒子間的疏水相互作用[24]，與掃描電鏡的結(jié)果一致。因此，超聲波輔助糖基化修飾最有可能是通過改變蛋白質(zhì)聚集體的結(jié)構(gòu)，而不是通過阻斷酶促反應(yīng)的切割位點來降低胃消化階段β-Lg的消化率和致敏性[25]。同時，由超聲波輔助糖基化修飾引起的空間位阻和靜電相互作用的增加，可能不僅阻礙了蛋白質(zhì)的聚集過程，而且還阻礙了胃蛋白酶和胰蛋白酶活性中心與消化底物之間的結(jié)合方式，從而影響機體對過敏位點的識別[26]。

表2 β-Lg-N和β-Lg-Lac-300消化產(chǎn)物的粒徑分布和ζ-電位

2.5 熒光光譜

由圖4可知，與β-Lg-N相比，β-Lg-Lac-300的熒光強度峰值降低，最大發(fā)射波長發(fā)生紅移，從342 nm處移至366 nm處。胃腸消化后，熒光強度峰值呈先升高后降低的趨勢，其中β-Lg-N腸消化后熒光強度峰值最低，且均出現(xiàn)紅移，但紅移程度不及β-Lg-Lac-300樣品。這表明糖基化后β-Lg的Tyr殘基所處微環(huán)境的親水性增加，消化過程中β-Lg-N與β-Lg-Lac-300肽鏈的結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部的Trp殘基逐漸暴露，消化產(chǎn)物的Tyr殘基的疏水性增加，肽段的重新聚合又使Trp殘基逐漸被掩埋[27]。說明β-Lg-Lac-300致敏性下降主要是因為乳糖對其線性表位的修飾，而隨消化時間的延長，構(gòu)象表位被破壞，其線性表位也不斷減少，但在消化末期仍保持一定致敏性，說明小分子短肽的特殊序列依然會使機體對蛋白過敏。

圖4 β-Lg-N和β-Lg-Lac-300消化產(chǎn)物的內(nèi)源熒光光譜

同步熒光光譜中，Δλ為15 nm時表征的是酪氨酸的同步熒光光譜，Δλ為60 nm時則是色氨酸[28]。由圖5可知，與β-Lg-N相比，糖基化后β-Lg-Lac-300的Tyr熒光強度均降低并伴有紅移，Trp的熒光強度未明顯改變。胃消化后，兩者的Tyr和Trp熒光強度升高，并出現(xiàn)藍移；腸消化后，兩者的熒光強度降低并出現(xiàn)輕微的紅移。說明消化過程中，Tyr和Trp微環(huán)境的疏水性先增強后逐漸減弱成親水，并產(chǎn)生了從Tyr到Trp殘基的能量轉(zhuǎn)移[29]。這可能是因為消化過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，暴露了最初被非極性氨基酸包圍的Tyr和Trp殘基，使其環(huán)境從弱極性變成強極性，而消化后期小分子肽段的聚集又使得Tyr和Trp殘基被掩蔽，其極性也隨之減弱[30]。而且糖基化干預(yù)了胃蛋白酶和胰蛋白酶對β-Lg三級結(jié)構(gòu)的破壞，與掃描電鏡、粒徑結(jié)果一致。說明糖基化對β-Lg 線性表位的修飾加上消化酶對其構(gòu)象表位的破壞顯著降低了β-Lg致敏性，也進一步說明了超聲波結(jié)合糖基化是降低β-Lg致敏性較為有效的方法。

圖5 β-Lg-N和β-Lg-Lac-300消化產(chǎn)物的同步熒光光譜

3 結(jié)論

試驗表明，超聲波結(jié)合糖基化處理對β-Lg腸胃消化性及消化過程中的致敏產(chǎn)生了顯著影響。胃消化60 min后產(chǎn)物的IgG/IgE結(jié)合能力迅速降低，且在胃腸消化120 min 時最低，其胃腸消化的水解度也降低。被修飾的β-Lg經(jīng)胃消化形成了更大的顆粒結(jié)構(gòu)，并在腸消化后期發(fā)生聚集；其熒光強度呈先升高后降低的趨勢并伴有紅移。綜上，超聲波結(jié)合糖基化改性可有效降低β-Lg在消化過程中的致敏性，β-Lg致敏性的變化與超聲波輔助糖基化修飾對其結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。后續(xù)應(yīng)利用蛋白質(zhì)組學(xué)、質(zhì)譜學(xué)、細胞學(xué)等技術(shù)，鑒別超聲波輔助糖基化β-Lg的糖基化位點以及消化后的致敏肽段，以期實現(xiàn)該技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用。