鄒 茜，鄧國華，張 駿，顧珊珊，戎 晗，康麗華，王 勇，管懷進(jìn)

0引言

年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)是我國乃至全球范圍內(nèi)首位致盲性眼病[1-2]。ARC的病因和發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，許多研究表明膽固醇代謝異?？赡芘c白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇的上游底物羊毛甾醇可以減少晶狀體的蛋白質(zhì)聚集，減少白內(nèi)障的形成[5-7]。羊毛甾醇的合成過程中最關(guān)鍵的限制酶是羊毛甾醇合成酶(LSS)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)[8-12]。前期研究表明DNA修復(fù)基因中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與ARC相關(guān)[13-14]。在本研究中，我們選擇了LSS和HMGCR基因的4個(gè)SNP位點(diǎn)(rs2968，rs9980968，rs12916，rs17238484)，并進(jìn)行了病例對(duì)照研究，以探討這4個(gè)SNP與ARC之間的關(guān)系。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象流調(diào)人群選擇2014年江蘇眼病啟東縣及阜寧縣研究基地[15]。晶狀體混濁程度按LOCSⅢ分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)[16]。ARC入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)晶狀體混濁；(2)最佳矯正視力<0.5；(3)年齡≥50歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)糖尿病、葡萄膜炎、青光眼、高度近視、眼部外傷或者其他原因所引起的白內(nèi)障；(2)雙眼中有一眼為無晶狀體眼。

對(duì)照組的入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)晶狀體透明；(2)最佳矯正視力>0.5；(3)年齡≥50歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有葡萄膜炎、青光眼、近視、晶狀體脫位、黃斑疾病等其他眼??；(2)患有糖尿病、癌癥、腎臟疾病、自身免疫病等全身性疾病。并且要求對(duì)照組與ARC組患者性別及年齡均匹配。在知情同意的情況下，采集外周靜脈血。本研究通過南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有人群均被告知研究意義并簽訂了知情同意書。流調(diào)人群研究對(duì)象一般資料見表1。

表1 流調(diào)人群對(duì)照組與ARC組一般資料

本研究還從常州市第三人民醫(yī)院眼科2018-08/2019-08住院期間選取了40例ARC患者(皮質(zhì)型、核型、后囊下型、混合型各10例)和10例進(jìn)行晶狀體摘除+玻璃體切除術(shù)的囊膜透明患者。兩組無年齡、性別差異(P>0.05)。在知情同意的情況下，手術(shù)時(shí)收取晶狀體囊膜[含晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells, LECs)]，用以測量LECs的目標(biāo)基因mRNA表達(dá)量。研究通過常州市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。研究對(duì)象一般資料見表2。納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)同流調(diào)人群。

表2 住院人群對(duì)照組與ARC組一般資料

1.2方法

1.2.1外周血DNA提取采用苯酚/氯仿/異戊醇法提取外周血中基因組DNA，并用Nanodrop測定所有血樣DNA濃度和純度，取OD260/OD280比值1.6～1.9純度要求的DNA。將DNA濃度稀釋到50μg/mL，登記后放入-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2篩選相應(yīng)SNPs通過NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)選取LSS及HMGCR的SNPs，所選位點(diǎn)滿足在北京的中國漢族人群中最小等位基因頻率(MAF)≥10%，并且利用在線工具(http://www.broadinstitute.org/mpg/snap)排除高度連鎖不平衡(r2≤0.8)4個(gè)SNPs位點(diǎn)，見表3。

表3 SNPs位點(diǎn)信息

1.2.3檢測基因型采用TaqMan RT-PCR法對(duì)所有SNPs位點(diǎn)進(jìn)行檢測。TaqMan探針是一段寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。每個(gè)SNPs位點(diǎn)分別以雙探針(VIC和FAM)熒光信號(hào)判定目的基因所含的野生位點(diǎn)和變異位點(diǎn)，在PCR反應(yīng)過程中，探針攜帶的熒光釋放，目的基因擴(kuò)增，相應(yīng)熒光強(qiáng)度增加，PCR儀器通過實(shí)時(shí)熒光探測系統(tǒng)探測不同波長熒光的強(qiáng)度，并隨時(shí)報(bào)告擴(kuò)增圖譜，從而對(duì)基因分型結(jié)果進(jìn)行識(shí)讀。用96孔板體外擴(kuò)增，每次檢測設(shè)4孔為空白對(duì)照。

1.2.4 LECs中RNA的提取及cDNA的制備行白內(nèi)障超聲乳化吸除術(shù)時(shí)，撕取5mm直徑的晶狀體中央前囊膜(含LECs)，用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)從晶狀體囊膜中提取總RNA。用Narodrop測定OD260/OD280值(1.7

1.2.5 qRT-PCR法檢測LECs中LSSmRNA表達(dá)量選取LSS(assay ID:Hs01552331_m1)，以人GAPDH(Hs02786624_g1)作為內(nèi)參，加入TaqMan Expression Master Mix(Thermos fisher)，用ABI公司的step-one型實(shí)時(shí)PCR儀分析，通過檢測熒光信號(hào)，比較LSS和內(nèi)參基因的Ct值，最后用2-ΔΔCt分析相關(guān)基因的表達(dá)情況。該實(shí)驗(yàn)對(duì)每個(gè)樣本重復(fù)做3次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Stata 17.0和Stata Corp統(tǒng)計(jì)軟件程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用HaploView4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較對(duì)照組和ARC組的年齡差異；采用卡方檢驗(yàn)比較其性別差異。采用卡方檢驗(yàn)分析對(duì)照組和ARC組及各型ARC組的等位基因頻率之間的關(guān)聯(lián)，并計(jì)算各基因型的哈迪-溫伯格平衡。當(dāng)?shù)任换蚍治鲋邪l(fā)現(xiàn)任何陽性結(jié)果時(shí)，用Bonferroni校正進(jìn)一步對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正，以Pa作為Bonferroni校正值。采用單因素方差分析來計(jì)算進(jìn)行qRT-PCR檢測結(jié)果的組間比較，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1對(duì)照組和ARC組基因SNPs位點(diǎn)基因型分布流調(diào)人群對(duì)照組和ARC組SNPs等位基因頻率分布LSS基因rs2968位點(diǎn)，對(duì)照組稀有等位基因占30.31%，ARC組占26.32%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)；但是Bonferroni校正后差異消失(P=0.072)。LSS基因rs9980968位點(diǎn)，對(duì)照組稀有等位基因占16.48%，ARC組占14.03%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MHGCR基因rs12916位點(diǎn)，對(duì)照組稀有等位基因占42.80%，ARC組占44.72%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MHGCR基因rs17238484位點(diǎn)，對(duì)照組稀有等位基因占32.81%，ARC組占31.32%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 SNPs位點(diǎn)基因型分布

分層分析后發(fā)現(xiàn)LSS基因rs2968位點(diǎn)，與核型ARC的等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，其中A等位基因?yàn)橐赘谢颉onferroni校正后差異依然存在(P=0.012)；與皮質(zhì)型、后囊下型、混合型均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表5 LSS-rs2968與各型ARC之間的關(guān)系%

2.2對(duì)照組和各型ARC患者LECs中LSS表達(dá)差異住院人群ARC組各亞型的LECs中LSS的mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)，各型ARC組間比較無差異，見圖1。

圖1 對(duì)照組及ARC前囊膜樣本中LSS mRNA的表達(dá) 各型ARC組晶狀體前囊膜樣本中LSS mRNA比對(duì)照組均低。aP<0.05 vs對(duì)照組。

3討論

ARC的病因和發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚。研究表明，基因與環(huán)境因素之間的相互作用，包括膽固醇代謝、年齡、性別、紫外線、氧化應(yīng)激等，都與ARC有關(guān)[3,10,13,17]。研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇的上游底物羊毛甾醇可以減少晶狀體的蛋白質(zhì)聚集，減少白內(nèi)障的形成[5-6]。羊毛甾醇和25-羥基膽固醇是兩種機(jī)制上不同的抗白內(nèi)障藥物先導(dǎo)化合物[18]。但目前尚未找到合適的溶劑溶解羊毛甾醇[5]。羊毛甾醇的合成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及20多個(gè)步驟[8-12]，其中最關(guān)鍵的限制酶是LSS和HMGCR[9,12]。LSS是羊毛甾醇合成酶，又稱環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶(oxidosqualene cyclase,OSC)，是在生物界普遍存在的一類酶，參與動(dòng)植物的多項(xiàng)生理活動(dòng)，具有調(diào)節(jié)脂類代謝的生理功能[9,11,19]。HMGCR催化HMGCoA生成甲羥戊酸，是膽固醇合成途徑中關(guān)鍵的限速步驟[10,12]。我們推測LSS和HMGCR可能與ARC發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

已有研究表明抑制LSS活性可誘導(dǎo)大鼠晶狀體混濁，若同時(shí)加入羊毛甾醇能有效地延遲晶狀體混濁的發(fā)生[20]。LSS能在晶狀體上皮細(xì)胞的變性和凋亡的早期階段起保護(hù)作用來預(yù)防白內(nèi)障[9]。研究表明20號(hào)染色體上的LSS可能是具有遺傳性白內(nèi)障特征的大鼠發(fā)生白內(nèi)障的主要致病基因[21]。研究發(fā)現(xiàn)，LSS的遺傳變異與慢性腎臟損傷[22]以及神經(jīng)外胚層綜合征[23]有關(guān)。Zhao等[5]在先天性白內(nèi)障的LSS基因上發(fā)現(xiàn)了突變位點(diǎn)(W581R和G588S)，后又有人報(bào)道了先天性白內(nèi)障患者的LSS基因存在突變[24]，證實(shí)LSS可能與人類白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)，因此我們進(jìn)一步推測LSS和HMGCR的遺傳變異可能與ARC有關(guān)。SNP是人類基因組中最豐富的一種遺傳變異形式，存在于DNA的任何區(qū)域，包括內(nèi)含子、編碼區(qū)和非翻譯區(qū)[25]。我們也報(bào)道了DNA修復(fù)基因中的SNPs與ARC相關(guān)[13-14]。在本研究中，我們選擇了LSS和HMGCR的4個(gè)SNPs，并發(fā)現(xiàn)LSS-rs2968與核型ARC相關(guān)，其中A等位基因?yàn)橐赘谢?。研究表明，LSS在大鼠和人白內(nèi)障晶狀體中的表達(dá)均呈下降趨勢[20-21]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，所有ARC亞型的LECs中LSS的表達(dá)均下降。

綜上所述，我們的結(jié)果表明，LSS-rs2968基因可能影響漢族人群核型ARC的易感性。與對(duì)照組相比，所有ARC亞型的LSS表達(dá)均下降。但我們還沒有解釋LSS-rs2968與ARC的易感性相關(guān)以及ARC患者LECs中LSS下降之間的聯(lián)系。rs2968位于LSS基因的3’-UTR區(qū)，可能該SNP改變了LSS與微小RNA(miRNAs)的結(jié)合。在可能的情況下，未來的研究應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，擴(kuò)大流行病學(xué)人群樣本量，以探索SNPs和ARC之間的關(guān)系。另外我們將繼續(xù)收集臨床患者樣本并進(jìn)行基因型檢測，闡明不同基因型的患者之間LECs中是否存在LSS的表達(dá)差異，并進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析和其他實(shí)驗(yàn)階段解釋兩者之間的相關(guān)機(jī)制。