李 倩，何 飛，張 然

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy， DR)是糖尿病的一種嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致失明的主要原因，通常主要影響年齡在30～70歲的人群[1]。糖尿病影響視網(wǎng)膜的整個(gè)神經(jīng)血管單位，逐漸病變并最終纖維化，且發(fā)病率越來(lái)越高[2]。然而，DR目前的治療選擇仍然有限且有副作用，因此糖尿病患者最終失明的風(fēng)險(xiǎn)仍然存在[3]。雖然DR是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥，但我們對(duì)其潛在的分子機(jī)制知之甚少。近年來(lái)，C57BL/KsJ-db/db小鼠作為2型糖尿病的自發(fā)性糖尿病模型用于研究DR的發(fā)病機(jī)制[4]。本研究選取基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)中的db/db小鼠芯片GSE55389，采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行全面分析，以期望從分子水平上得到新的生物標(biāo)記物，靶點(diǎn)蛋白和通路，從而為DR的早期診斷和治療靶點(diǎn)研究提供新的突破。

1材料和方法

1.1材料基因芯片GSE55389數(shù)據(jù)集下載自GEO網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，該芯片數(shù)據(jù)集共有8個(gè)從視網(wǎng)膜提取的RNA樣本(其中DR組選用4例8周齡糖尿病db/db小鼠；對(duì)照組選取4例正常仔鼠)，然后與Affymetrix小鼠基因1.0ST陣列雜交。原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，在R語(yǔ)言(3.4.1版)(http://www.bioconductor.org)使用RMA(the robust multichip averaging)算法將其轉(zhuǎn)換為表達(dá)式值。

1.2方法

1.2.1差異表達(dá)基因分析采用RankProd軟件包進(jìn)行差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)分析。RankProd是一種非參數(shù)Meta分析工具，其利用每個(gè)基因的折疊變化(FC)對(duì)每個(gè)區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行排序和比較。通過(guò)對(duì)源數(shù)據(jù)集進(jìn)行1000次置換計(jì)算顯著性值和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)值。僅假陽(yáng)性率(PFP)值≤0.05的基因被認(rèn)為是DR組和對(duì)照組之間的DEGs。

1.2.2 DEGs的基因本體分析和通路富集分析使用ClusterProfiler軟件包進(jìn)一步對(duì)所識(shí)別的DEGs進(jìn)行功能解釋，即基因本體(GO)分析和通路分析。GO分析使用0.05的閾值識(shí)別顯著豐富的GO術(shù)語(yǔ)。通路分析利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，閾值為0.05。

1.2.3基因集富集分析使用基因集富集分析(GSEA)統(tǒng)計(jì)方法將基因組中基因的非平均強(qiáng)度值與其在生物通路中的發(fā)生聯(lián)系起來(lái)。對(duì)于富集研究，本研究允許最小基因集大小為10，以避免隨機(jī)注釋。加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)用于計(jì)算1000個(gè)置換數(shù)的富集分?jǐn)?shù)。FDR<0.05的富集基因集被認(rèn)為是重要的通路。

1.2.4蛋白質(zhì)相互作用分析使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)STRING(10.5版)(https://string-db.org/)對(duì)篩選的DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析。將綜合得分>0.4的配對(duì)用于構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，然后使用Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)并分析DR中候選DEGs編碼蛋白之間的相互作用關(guān)系。為了探索更具體的蛋白質(zhì)調(diào)控關(guān)系，本研究在Cytoscape軟件中使用了ClusterONE插件在P<0.1的條件下挖掘聚類模。

1.2.5轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合分析基于調(diào)控基序和染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序?qū)ふ液蜻x轉(zhuǎn)錄因子(TFs)，使用cytoscapev3.5.1中的iRegulon應(yīng)用程序搜索DR基因的調(diào)節(jié)因子。iRegulon通過(guò)掃描已知的TFs結(jié)合啟動(dòng)子基序以及從DNA元素百科全書(shū)計(jì)劃(ENCODE)染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的預(yù)測(cè)基序檢測(cè)TFs及其靶點(diǎn)。在“假定監(jiān)管區(qū)域”“Motif排名數(shù)據(jù)庫(kù)”和“跟蹤排名數(shù)據(jù)庫(kù)”選項(xiàng)的上游設(shè)置20kb，其他選項(xiàng)被視為默認(rèn)選項(xiàng)。DEGs被加載到Cytoscape[5]，并用于查詢iRegulon插件[6]。假定的調(diào)控區(qū)域選擇以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)為中心的20kb為范圍，歸一化富集分?jǐn)?shù)(NES)閾值設(shè)為4.0，模體相似性的最大FDR設(shè)定為0.001。運(yùn)行iRegulon并以每個(gè)下調(diào)和上調(diào)的基因?qū)ふ襎Fs。

2結(jié)果

2.1 DR的DEGs在穩(wěn)態(tài)條件下對(duì)肥胖db/db小鼠視網(wǎng)膜組織與正常小鼠視網(wǎng)膜組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，通過(guò)使用RankProd軟件包共得到66個(gè)DEGs，其中38個(gè)基因上調(diào)，28個(gè)基因下調(diào)，PFP≤0.05。

2.2 DEGs的GO分析如圖1、2，表1、2所示，在生物學(xué)過(guò)程組中，上調(diào)基因GO項(xiàng)無(wú)顯著性差異，下調(diào)基因主要集中在眼睛發(fā)育、相機(jī)型眼發(fā)育、視知覺(jué)、光刺激感覺(jué)知覺(jué)和相機(jī)型眼晶狀體發(fā)育。在細(xì)胞組分中，上調(diào)基因主要富集于細(xì)胞漿核糖體、細(xì)胞漿部分、呼吸鏈、核糖體亞單位、核糖體、細(xì)胞漿小核糖體亞單位、小核糖體亞單位、血液微粒、中間絲，下調(diào)基因主要富集于細(xì)胞體纖維。在分子功能中，上調(diào)基因主要富集于氧結(jié)合、過(guò)氧化物酶活性、氧化還原酶活性、過(guò)氧化物受體、抗氧化活性、NADH脫氫酶(泛醌)活性、NADH脫氫酶(醌)活性、血紅素結(jié)合、NADH脫氫酶活性、四吡咯結(jié)合，下調(diào)基因主要富集于晶狀體結(jié)構(gòu)成分。上述結(jié)果表明，多數(shù)DEGs在細(xì)胞漿核糖體、眼睛發(fā)育和氧結(jié)合方面均顯著富集。

表1 DR中上調(diào)基因的顯著富集GO分析

表2 DR中下調(diào)基因的顯著富集GO分析

圖1 基因本體分析及DR中上調(diào)基因GO術(shù)語(yǔ)的顯著富集。

圖2 基因本體分析及DR中下調(diào)基因的GO術(shù)語(yǔ)顯著富集。

2.3通路分析上調(diào)基因主要在氧化磷酸化、帕金森病、心肌收縮、非洲錐蟲(chóng)病、瘧疾和核糖體中富集，而在下調(diào)基因中沒(méi)有明顯的富集通路(表3)。

表3 db/db小鼠視網(wǎng)膜上調(diào)基因的顯著富集通路

2.4基因富集分析GSEA用于識(shí)別DR中的重要通路。FDR<0.05時(shí)，發(fā)現(xiàn)了12條上調(diào)通路和6條下調(diào)通路(表4、5)。上調(diào)通路主要包括脂肪消化吸收、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、組氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、氧化磷酸化。

表4 GSEA分析判定的上調(diào)通路

表5 GSEA分析判定的下調(diào)通路

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用STRING構(gòu)建一個(gè)由40個(gè)基因和61個(gè)相互作用組成的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。Top2a、Cryaa、mt-Cytb、Mip、Rps3、Rpl27a、Rpl13a、Rpl23、Cryba1和Crygd是最顯著的10個(gè)節(jié)位基因，其可能在DR的病理進(jìn)程中起重要作用(表6)。應(yīng)用Cytoscape軟件中的ClusterONE插件對(duì)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類模塊分析，以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)復(fù)合物，結(jié)果確定了5個(gè)DEGs模塊(圖3，表7)。模塊簇1富含參與氧化磷酸化的基因；模塊簇2富集于中間絲細(xì)胞骨架組織；模塊簇5在眼睛發(fā)育方面豐富。

表6 PPI網(wǎng)絡(luò)前10節(jié)點(diǎn)的度

表7 PPI網(wǎng)絡(luò)中標(biāo)識(shí)的模塊簇

圖3 利用db/db小鼠視網(wǎng)膜DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò) 從PPI網(wǎng)絡(luò)中識(shí)別模塊簇，節(jié)點(diǎn)表示DEGs，線表示DEGs之間的度。

2.6 iRegulon預(yù)測(cè)調(diào)控基因集的TFs利用Cytoscape軟件中的iRegulon應(yīng)用程序搜索DR相關(guān)基因集的TFs，對(duì)于每個(gè)上調(diào)和下調(diào)的基因集，基于上游20kb的motif預(yù)測(cè)了上調(diào)基因集的5個(gè)TFs和下調(diào)基因集的8個(gè)TFs。對(duì)上調(diào)基因的分析表明，Runx家族、Ifap2a和Ppara等靶基序的富集，表明這些TFs可能驅(qū)動(dòng)差異基因表達(dá)(表8)。與下調(diào)基因相關(guān)的TFs包括Gata2、Hoxa13、Tbp和Runx3等(表9)。

表8 與上調(diào)基因相關(guān)的TFs預(yù)測(cè)

表9 與下調(diào)基因相關(guān)的TFs預(yù)測(cè)

3討論

DR是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，也是眼科常見(jiàn)致盲性眼病之一，其發(fā)病的分子機(jī)制仍有待探究。db/db小鼠視網(wǎng)膜基因表達(dá)譜的應(yīng)用，為本研究提供了從生物信息學(xué)方面研究DR發(fā)病機(jī)制的可能性，對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的挖掘有助于從中發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)記和診斷/治療靶點(diǎn)基因。

本研究對(duì)基因芯片GSE55389進(jìn)行生物信息學(xué)軟件分析，共發(fā)現(xiàn)66個(gè)DEGs，并對(duì)這些DEGs進(jìn)行GO富集分析、KEGG信號(hào)通路分析和PPI網(wǎng)絡(luò)分析。為避免只選擇差異明顯的基因而導(dǎo)致某些可能的信號(hào)通路被遺漏，本研究同時(shí)進(jìn)行GSEA分析。利用iRegulon分析預(yù)測(cè)DR相關(guān)基因的TFs，其中，上調(diào)表達(dá)的有Runx2、Ifap2a、Ppara、MafA；下調(diào)表達(dá)的有Gata2、Hoxa13、Tbp和Runx3等，表明這些TFs可能驅(qū)動(dòng)差異基因表達(dá)。Runx2是轉(zhuǎn)錄因子RUNX家族的一員，編碼1個(gè)帶有Runt-DNA結(jié)合域的核蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化在終末期腎臟疾病中非常普遍，PARP1通過(guò)上調(diào)Runx2促進(jìn)血管鈣化[7]；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞參與血管發(fā)生，是血管發(fā)生過(guò)程中最重要的血管生長(zhǎng)因子，而Runx2是VEGF啟動(dòng)子的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[8]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs)是調(diào)節(jié)特定基因的配體依賴的核受體超家族中的成員，包括α、β、γ三個(gè)亞型。它們參與脂質(zhì)和糖代謝的調(diào)節(jié)。研究證明PPARs在調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體增殖、細(xì)胞分化、能量代謝、炎癥反應(yīng)及血管保護(hù)作用等過(guò)程中扮演著重要角色[9-10]。

Maf家族蛋白是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種蛋白的表達(dá)和細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等發(fā)揮作用。目前已知有4種類型的Maf—MafA、MafB、c-Maf和NRL。其中，MafA在胰腺β細(xì)胞中特異表達(dá)，對(duì)胰島素的轉(zhuǎn)錄和分泌至關(guān)重要。作為一種葡萄糖調(diào)節(jié)的胰島β細(xì)胞特異性胰島素基因轉(zhuǎn)錄激活因子[11]，MafA能特異性結(jié)合胰島素增強(qiáng)元件RIPE3b并激活胰島素基因表達(dá)[12]，并且是體內(nèi)葡萄糖刺激胰島素分泌的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13]。在db/db模型小鼠的研究表明，在2型糖尿病進(jìn)展的早期階段，MafA蛋白在胰島β細(xì)胞中丟失[14]。Gata2是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮素-1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活劑，可結(jié)合共識(shí)序列5’-AGATAG-3’。該基因編碼的蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)參與造血和內(nèi)分泌細(xì)胞系發(fā)育和增殖的基因轉(zhuǎn)錄中起著至關(guān)重要的作用[15]。HOXA13在脊椎動(dòng)物中編碼一類被稱為同源盒基因的轉(zhuǎn)錄因子的基因，被發(fā)現(xiàn)在4條不同的染色體上的A、B、C、D簇中。這些蛋白質(zhì)的表達(dá)在胚胎發(fā)育過(guò)程中受到時(shí)空調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，HOXA13在發(fā)育過(guò)程中與胎盤血管形成模式和迷路內(nèi)皮規(guī)范有關(guān)[16]。研究表明，Runx3的低表達(dá)與各類腫瘤異常血管增生、轉(zhuǎn)移[17]和肝臟異常分化[18]有關(guān)。糖尿病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞功能也與Runx3表達(dá)異常相關(guān)[19]。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜和正常小鼠視網(wǎng)膜組織樣本的基因表達(dá)譜進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，確定了以db/db小鼠為模型的DR的關(guān)鍵基因和通路，進(jìn)一步分析了DR中轉(zhuǎn)錄因子與視網(wǎng)膜微血管增殖的可能分子機(jī)制，這些DEGs可能參與DR發(fā)生、發(fā)展的多種通路。除了上述生物信息學(xué)的探索外，還需要后續(xù)通過(guò)確鑿的實(shí)驗(yàn)工作來(lái)確認(rèn)所識(shí)別基因的功能。