閆 瑾，王 莉，李 蓉，楊 揚，劉文蘭，朱 丹，焦 聰

0引言

外泌體(exosomes)是一種具有磷脂雙分子層膜結構的細胞外微囊泡，直徑范圍40～100nm[1]，攜帶脂質、蛋白質、核酸以及細胞因子等多種內容物[2]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于多種組織中的一類干細胞，具備多向分化潛能[3]，具有不易引起免疫反應、易于獲得和可體外分離連續(xù)傳代培養(yǎng)等優(yōu)勢[4]。作為視網(wǎng)膜外屏障的組成部分，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞具有多種復雜生理生化功能，其分泌的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進新生血管形成的關鍵因子[5-7]。自噬是真核細胞在生理和病理狀態(tài)下均存在的一種動態(tài)的生理過程，通過溶酶體介導了細胞內蛋白質和衰老受損細胞器等大分子物質的代謝和降解，利用自噬這一更新過程維持細胞的正常代謝內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8]。既往研究顯示，在高糖、缺氧或炎癥等環(huán)境下，視網(wǎng)膜自噬水平明顯異常，進而參與眼部疾病的發(fā)生和發(fā)展[9-12]。隨著MSCs外泌體與眼科疾病相關研究的開展，發(fā)現(xiàn)MSCs外泌體在視神經(jīng)損傷、年齡相關性黃斑變性及角膜疾病的治療中表現(xiàn)出潛在的價值[13-17]。本研究以人RPE細胞作為研究對象，觀察人臍帶間充質干細胞(human umbilical mesenchymal stem cells, hUMSC)源外泌體對高糖環(huán)境下人RPE細胞的自噬和VEGF表達水平的影響，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供新的可能性。

1材料和方法

1.1材料經(jīng)產婦本人及家屬簽署臍帶用于實驗研究的知情同意書及學院倫理委員會批準后，取健康足月嬰兒臍帶。人ARPE-19株(武漢普諾賽生命科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清(美國Gibco公司)；兔多抗自噬標志性蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-related protein 1 light chain 3, LC3)B(Ab48394)、兔單抗CD90(ab133350)、兔單抗CD63(ab134045)(英國abcam公司)；兔多抗Beclin-1(3495S，美國CST公司)；兔多抗p62(AF5384，美國Affinity Biosciences公司)；兔多抗GAPDH(AB-P-R 001，杭州賢至生物有限公司)；HRP標記羊抗兔二抗(BA1054，武漢博士德生物工程有限公司)；外泌體提取試劑盒Total Exosome Isolation (from cell culture media)(4478359，美國Invitrogen公司)；噻唑蘭MTT(3580MG250，德國BIOFROX公司)；人VEGF ELISA試劑盒(Human VEGF-A ELISA Kit E-EL-H0111c武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司，型號ECLIPSE Ts2)；微型高速離心機(美國Labnet公司，型號C2500-R-230V)；全自動酶標儀(美國Thermo scientific公司，型號mμlISKANMK3)；透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司，型號HT7700-SS)。

1.2方法

1.2.1 hUMSC的分離和培養(yǎng)及鑒定組織塊貼壁法分離培養(yǎng)hUMSC[18]。組織塊附著后添加含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，每隔3d換液，待細胞融合達80%～90%時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代，比例為1∶3。hUMSC細胞傳代至第3代，胰酶消化離心后加入兔單抗CD90，4℃孵育后Western blot印跡檢測。

1.2.2 hUMSC外泌體的提取取第4～5代生長良好的hUMSC細胞，用10%exo-FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，收集細胞上清液，2000g離心30min以去除細胞、碎片等。將離心后獲得的上清液與外泌體提取試劑按2∶1混勻，4℃孵育過夜后10000g離心1h，保留沉淀，即為外泌體。加入PBS重懸外泌體，將重懸后的外泌體分裝保存于-80℃冰箱。

1.2.3外泌體鑒定及結構觀察外泌體蛋白鑒定：蛋白樣品上樣，凝膠電泳至目的蛋白有效分離。轉膜，5%脫脂奶粉封閉2h。將膜與一抗CD63(1∶1000)于4℃孵育過夜。將膜浸泡于HRP標記二抗(1∶50000)中，37℃搖床孵育2h。ECL試劑盒顯影曝光，分析處理膠片中蛋白條帶的灰度值。外泌體結構觀察：質量分數(shù)2%多聚甲醛固定外泌體懸液，滴樣本于載樣銅網(wǎng)上，3%磷鎢酸染色5min，室溫干燥，透射電鏡觀察外泌體結構并拍照。

1.2.4細胞培養(yǎng)及分組選用DMEM/F12(含10% FBS+1%青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)ARPE-19細胞，實驗選用處于對數(shù)生長期的第5～10代，按照5.0×105個/孔傳代于6孔板內，隨機分為對照組、高糖組和外泌體+高糖組，對照組在無糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，高糖組在培養(yǎng)基中加入25mmol/L D-glucose，外泌體+高糖組先用75μg/mL外泌體預處理12h后，置于含25mmol/L D-glucose的培養(yǎng)基中，三組培養(yǎng)時間均為48h。

1.2.5 MTT法檢測ARPE-19細胞增殖率使用微量酶比色法測定試劑盒，根據(jù)說明書檢測ARPE-19細胞增殖率。細胞增殖率(%)=(實驗組平均OD值-空白孔平均OD值)/(對照組平均OD值-空白孔平均OD值)×100%。

1.2.6透射電子顯微鏡下觀察自噬體的形成刮取各組細胞，戊二醛固定2h，充分漂洗后，在質量分數(shù)為1%鋨酸中4℃固定，脫水，包埋。在裸銅網(wǎng)格上制備超薄切片，鈾鉛雙染色，透射電子顯微鏡下觀察自噬體形態(tài)、結構及數(shù)量，拍照。

1.2.7 Western blot法檢測各組ARPE-19細胞中自噬蛋白LC3B、Beclin-1和p62的表達收集各組細胞裂解充分后，離心提取總蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉，滴加一抗，一抗稀釋濃度如下：LC3B(1∶1000)、Beclin-1(1∶1000)、p62(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶50000)孵育。暗室顯影，依據(jù)膠片灰度值，與內參GAPDH比較計算出LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值及Beclin-1和p62蛋白相對表達量，每組3次生物學重復，取平均值。

1.2.8 ELISA法檢測ARPE-19細胞VEGF蛋白表達按照使用說明，采用人VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測ARPE-19細胞上清液中VEGF蛋白濃度。酶標儀測量OD450值。應用直線相關回歸分析，在標準曲線上查出待測樣本對應的VEGF濃度。

2結果

2.1 hUMSC的形態(tài)觀察及鑒定使用倒置顯微鏡觀察臍帶華通氏膠組織(Wharton jelly)貼壁培養(yǎng)的第3代hUMSC細胞呈長梭形或紡錘形，形態(tài)均一，緊密排列，類似纖維細胞，集落生長，細胞分布呈魚群狀或漩渦狀(圖1A)。Western blot檢測hUMSC陽性表達CD90(圖1B)，符合MSCs鑒定標準。

圖1 hUMSC的形態(tài)觀察及鑒定 A：光學顯微鏡觀察第3代hUMSC形態(tài)(×100)。hUMSC細胞培養(yǎng)至第3代，呈成纖維細胞樣的長梭形，渦旋狀排列;B:Western blot檢測hUMSC表面標志蛋白CD90。

2.2 hUMSC外泌體超微結構觀察及鑒定經(jīng)透射電鏡觀察可見分離純化后的外泌體為內含低電子密度成分的球狀或橢球狀膜性囊泡，直徑范圍30～100nm。外泌體囊泡外圍可見類質脂膜性結構(圖2A)。蛋白免疫印跡法顯示，hUMSC外泌體陽性表達特異性標志蛋白CD63(圖2B)。

圖2 hUMSC外泌體形態(tài)及鑒定 A：透射電可見hUMSC外泌體為球狀或橢球狀膜性囊泡，直徑約30～100nm；B：Western blot檢測hUMSC外泌體表面標志蛋白CD63。

2.3細胞中自噬體超微結構的觀察透射電子顯微鏡下可見典型的自噬體為包裹了蛋白質及細胞器等吞噬物的小囊泡，具備雙層膜結構。電鏡檢查顯著反映了高糖環(huán)境及hUMSC外泌體對ARPE-19細胞自噬活性的影響，對照組細胞中僅見少量自噬體，高糖組及外泌體+高糖組細胞中自噬體數(shù)量明顯增多，而外泌體+高糖組細胞中自噬體數(shù)量較高糖組減少(圖3)。

圖3 透射電子顯微鏡下觀察各組ARPE-19細胞內自噬體形成 A:對照組;B高糖組;C:外泌體+高糖組。

2.4 hUMSC外泌體對高糖條件下ARPE-19細胞增殖的影響MTT法檢測結果顯示，各組ARPE-19細胞增殖率的總體比較差異有統(tǒng)計學意義(表1)。與對照組相比，高糖組和外泌體+高糖組細胞增殖率降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，外泌體+高糖組細胞增殖率高于高糖組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 hUMSC外泌體對高糖條件下ARPE-19細胞增殖、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p62蛋白相對表達量及VEGF的影響

2.5 hUMSC外泌體對ARPE-19細胞在高糖條件下LC3B-Ⅱ/Ⅰ值和Beclin-1及p62蛋白相對表達量的影響蛋白免疫印跡法檢測結果顯示，高糖組ARPE-19細胞的LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin-1蛋白條帶明顯增強，p62蛋白表達降低，自噬活性較對照組明顯升高。加入hUMSC外泌體預處理后，LC3B-Ⅱ/Ⅰ值及Beclin-1的蛋白表達減弱，p62的表達明顯增強(圖4)。

圖4 各組細胞中LC3B、Beclin-1和p62蛋白電泳圖 A:對照組;B高糖組;C:外泌體+高糖組。

對照組、高糖組、外泌體+高糖組ARPE-19細胞的LC3B-Ⅱ/Ⅰ值、Beclin-1和p62的相對蛋白表達量的組間總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01,表1)。組間比較顯示，對照組和外泌體+高糖組細胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ值和Beclin-1的相對蛋白表達相較于高糖組顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，外泌體+高糖組的LC3B-Ⅱ/Ⅰ值與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.055)，外泌體+高糖組Beclin-1的相對蛋白表達相較于對照組有所升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。對照組和外泌體+高糖組細胞中p62的相對蛋白表達相較于高糖組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，外泌體+高糖組中p62的相對蛋白表達相較于對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.6 hUMSC外泌體對高糖條件下ARPE-19細胞上清液中VEGF蛋白表達量的影響酶聯(lián)免疫吸附試驗顯示，對照組、高糖組、外泌體+高糖組ARPE-19細胞上清液中VEGF的質量濃度的整體比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。相較于對照組和外泌體+高糖組，高糖組VEGF的質量濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，外泌體+高糖組細胞VEGF質量濃度低于高糖組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3討論

絕大部分細胞都會向細胞外環(huán)境中釋放外泌體，外泌體在遠距離細胞間的相互作用中發(fā)揮了重要作用，是細胞間相互交流的一種媒介，蛋白質是外泌體攜帶的常見成分，因此可以作為特異性標記物，在外泌體提取過程中用于鑒定和定量[19-20]。hUMSC有促進組織修復、調節(jié)免疫反應、抑制炎癥等作用[21]。既往多項研究表明MSCs外泌體的功能和活性與其親代細胞相似，與間充質干細胞相比，MSCs外泌體體積小、無免疫原性而且更加穩(wěn)定，具有治療多種疾病的潛能[1]。本研究利用外泌體分離提取試劑盒成功提取了hUMSC外泌體，并通過透射電鏡觀察其形態(tài)和超微結構，鑒定了外泌體特異性標志物CD63，多種方法驗證了外泌體提取結果的可靠性。

RPE層位于視網(wǎng)膜的最外層，為單層色素細胞，主要功能包括：維持光感受器的新陳代謝、吸收光線、抗氧化、為視網(wǎng)膜外層提供營養(yǎng)、參與視覺循環(huán)和分泌細胞因子等，對維持視網(wǎng)膜光感受器微環(huán)境有重要作用。長期處于高血糖環(huán)境會誘發(fā)RPE細胞出現(xiàn)缺血、氧化應激、炎癥激活等病理改變，影響其結構和功能[5]。He等[1]模擬年齡相關性黃斑變性，將hUMSC外泌體與藍光損傷RPE細胞共培養(yǎng)，并向激光誘導視網(wǎng)膜損傷小鼠玻璃體腔內注射不同劑量外泌體，發(fā)現(xiàn)hUMSC外泌體顯著降低VEGF-A表達，修復藍光損傷視網(wǎng)膜，保護RPE細胞。本研究通過體外模擬高糖狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)高糖處理48h可以造成RPE細胞損傷，明顯降低其增殖率，導致細胞活力下降。hUMSC外泌體干預可使細胞的增值率升高，對高糖環(huán)境下的RPE細胞有顯著的保護作用。

自噬存在于生理狀態(tài)下的細胞中，自噬水平維持在一定范圍內對細胞的代謝、增殖、生長、分化、修復以及活性的維持都起到重要作用[8，22]。在自噬這一動態(tài)過程的不同階段中，相關特異性基因編碼的LC3，Beclin-1和p62等20多種蛋白相互協(xié)同作用。LC3在主導自噬小體的雙膜延伸過程時，胞漿中的LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)生成位于自噬小體膜上的脂質型LC3-Ⅱ，可以通過檢測LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的轉化比例評估自噬的水平[23]，LC3存在多種不同類型，目前自噬的蛋白標記物常選用LC3B。絕大多數(shù)自噬相關蛋白在參與自噬小體的形成中均需要Beclin-1輔助[24]，因此Beclin-1蛋白表達量也是檢測自噬水平的常用標記物。p62是自噬溶酶體膜相關標記蛋白，其表達與自噬水平負相關，在自噬過程中主要介導底物識別，因此當自噬反應激活清除細胞內的蛋白質時會被優(yōu)先降解，從而導致其表達水平降低[25]。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測LC3B的切割情況、Beclin-1的蛋白相對表達量及p62的降解程度，三項結果共同檢測RPE細胞的自噬水平。目前認為檢測自噬情況的金標準是電子顯微鏡觀察到自噬小體的特征性雙層膜結構[23]，但在自噬發(fā)生的不同動態(tài)階段中，會產生與自噬小體形態(tài)類似的自噬溶酶體和自噬內涵體，在未做特殊標記的情況下，很難準確區(qū)分這些結構。此外在不同切面的切片中觀察到的自噬小體數(shù)量差別較大，會導致電鏡檢測結果產生誤差。因此本文根據(jù)自噬標志性蛋白檢測和電鏡觀察兩種結果，綜合分析細胞內的自噬水平，確保實驗結果的準確性和可靠性。已有的研究結果顯示，高糖條件會上調視網(wǎng)膜自噬水平，進而誘導DR的發(fā)生[12]。Lopes等[11]在體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞,并檢測p62蛋白的降解情況，發(fā)現(xiàn)高糖會增強Müller細胞的自噬反應，誘導其大量釋放VEGF。本研究證實，高糖環(huán)境下RPE細胞的自噬被激活，表現(xiàn)為自噬體增加，LC3B-Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1蛋白表達增加，而p62表達下降。用75μg/mLhUMSC外泌體預處理后，自噬體減少，細胞表達LC3B-Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1蛋白下降，p62水平增加。

視網(wǎng)膜新生血管是糖尿病視網(wǎng)膜病變晚期的典型病理性改變，在參與糖尿病新生血管生成的眾多細胞因子中，VEGF是其中具有高度特異性的血管內皮細胞促有絲分裂素，可以破壞血-視網(wǎng)膜屏障，引起組織缺氧、毛細血管閉塞及微血栓形成，導致滲出、出血以及水腫。還可以增加血管通透性，促進血管內皮細胞分裂增殖，誘導血管生成[6-7]。同時視網(wǎng)膜血管內皮細胞在高糖環(huán)境誘導下VEGF受體增多、與VEGF親和力增強，進一步提高了VEGF與受體的結合率，促使血管內皮細胞增殖[26]。我們的研究結果顯示，高糖會導致REP細胞表達VEGF明顯增加，hUMSC外泌體有效降低VEGF水平，與既往研究結果一致[1]。

綜上所述，本研究提示高糖環(huán)境下RPE細胞自噬被激活，hUMSC外泌體可有效抑制高糖環(huán)境下ARPE-19細胞自噬水平，促進細胞增殖，并下調VEGF的表達，對RPE細胞起到保護作用。本研究為外泌體的應用提供了新的思路，外泌體作為能在細胞間起到調控作用的囊泡結構，可能在糖尿病視網(wǎng)膜病變治療中起到重要作用。但目前所有的外泌體提取方法均有不足之處，獲得的外泌體中包含不同的干擾成分，造成提取物不同質問題[27]。hUMSC外泌體在體內對自噬水平的影響及安全性還需通過動物試驗來明確。另外，hUMSC外泌體在抑制高糖環(huán)境下ARPE-19細胞自噬，下調VEGF表達的過程中，發(fā)揮作用的具體成分，通過的機制及激活的信號通路均需要進一步更深入的研究和驗證。