胡平，陳平

(同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092)

自1989年美國食品藥品管理局批準(zhǔn)注射用A型肉毒毒素(botulinum toxin type A，BoNT/A)上市以來[1]，其應(yīng)用不斷拓展，目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療，且在神經(jīng)系統(tǒng)疾病(肌張力障礙、痙攣、疼痛、自主神經(jīng)功能障礙等)[2]、美容[3]、泌尿系統(tǒng)疾病[4]、癌癥引起的局部疼痛以及癌癥手術(shù)放療部位疼痛的緩解[5]、抑郁癥[6]等中具有重要作用。近年來，BoNT/A在治療泌尿系統(tǒng)疾病方面的應(yīng)用越來越多，主要包括膀胱括約肌協(xié)同失調(diào)以及神經(jīng)性逼尿肌過度活動引起的尿失禁，尤其對具有神經(jīng)源性膀胱過度活躍癥狀患者的療效較好[7]。臨床上，BoNT/A常被用于治療良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)、前列腺炎等。BPH發(fā)生時，間質(zhì)細胞增生、平滑肌細胞變得粗大且密集，上皮細胞增生主要表現(xiàn)為基底細胞的增生、肥大細胞由正常扁平變?yōu)榱⒎交虬鶢頪8]。BPH是造成中老年排尿障礙的一個重要原因，腺體增大會導(dǎo)致膀胱出口梗阻和下尿路癥狀等。而注射BoNT/A已成為臨床治療BPH患者的一種重要治療手段。目前治療前列腺炎的藥物主要包括抗菌藥物、抗炎藥物等，但均很難使患者痊愈。前列腺炎分為Ⅰ～Ⅳ型，其中Ⅲ型前列腺炎為慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征，BoNT/A對慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征治療效果較好[9]?，F(xiàn)就BoNT/A在前列腺疾病中的作用及機制研究進展予以綜述。

1 肉毒毒素簡介

1.1肉毒毒素結(jié)構(gòu) 肉毒毒素是由肉毒梭菌產(chǎn)生的一種神經(jīng)毒素蛋白，由肉毒神經(jīng)毒素和輔助蛋白組成；其分子量為150 000，由分子量為50 000的輕鏈和100 000的重鏈通過二硫鍵連接組成[10]。自然產(chǎn)生的肉毒毒素有7種，根據(jù)抗原性不同分為A、B、C、D、E、F和G型，其中BoNT/A應(yīng)用最多且毒性最強、作用時間最久。BoNT/A分子復(fù)合體的分子量為900 000，由分子量為150 000的神經(jīng)毒素和750 000的輔助蛋白組成，包含19種氨基酸[11]。

1.2BoNT/A作用機制 BoNT/A作用機制主要為BoNT/A輕鏈的內(nèi)切酶切割作為可溶性N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的融合蛋白附著蛋白受體復(fù)合體之一的突觸相關(guān)蛋白-25(synaptosomal-associated protein of 25 kDa，SNAP-25)，從而抑制突觸小泡與前膜融合，阻斷乙酰膽堿的釋放[12]。其作用過程主要分為：①BoNT/A重鏈與低親和力受體三涎酸神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，聚集細胞膜上的高親和力受體SV2(synaptic vesicle glycoprotein 2)，BoNT/A通過與低親和力及高親和力受體結(jié)合實現(xiàn)BoNT/A在細胞膜上聚集并形成胞內(nèi)體進入胞質(zhì)內(nèi)；②BoNT/A輕鏈在胞內(nèi)體的酸性環(huán)境中被切割成具有內(nèi)切酶活性的肽段；③在ATP酶供能下，BoNT/A重鏈易位區(qū)插入胞內(nèi)體的脂質(zhì)雙分子層上形成細小通道供輕鏈釋放至胞質(zhì)；④輕鏈的內(nèi)切酶活性肽段可以水解位于靶膜上的SNAP-25，在SNAP-25 C端移除9個氨基酸殘基，導(dǎo)致可溶性N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的融合蛋白附著蛋白受體復(fù)合體形成受阻，無法為膜融合提供能量，進而影響突觸小體與突觸前膜的融合，導(dǎo)致乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)無法釋放，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻[13]。除乙酰膽堿外，BoNT/A還可抑制突觸前膜釋放的去甲腎上腺素、降鈣素相關(guān)肽、P物質(zhì)和谷氨酸等[14]。

前列腺組織具有豐富的交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)，BoNT/A能夠作用于前列腺組織的原因為其可封閉局部交感神經(jīng)末梢分泌的腎上腺素和副交感神經(jīng)末梢分泌的乙酰膽堿。前列腺上皮細胞的過度增殖及平滑肌收縮均會導(dǎo)致前列腺疾病的發(fā)生，其中前列腺上皮細胞的生長受副交感神經(jīng)調(diào)控，激活膽堿能受體可促進前列腺上皮細胞生長和分泌，而交感去腎上腺素能神經(jīng)主要負責(zé)調(diào)控前列腺平滑肌收縮[15]?？梢?，應(yīng)用BoNT/A治療前列腺疾病主要是通過其阻斷神經(jīng)的傳導(dǎo)。另外，BoNT/A還可促進前列腺細胞凋亡，但具體機制目前尚不明確。

2 BoNT/A在BPH中的應(yīng)用

臨床上通過注射BoNT/A治療BPH，具有療效顯著、安全且耐受良好的特點。與應(yīng)用尿道前列腺電切術(shù)治療相比，前列腺內(nèi)注射BoNT/A治療可減小BPH患者前列腺體積、降低血清總前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)水平和殘余尿量[16]。與傳統(tǒng)藥物相比，BoNT/A具有更好的療效。如臨床治療發(fā)現(xiàn)，與抗膽堿能藥物相比，BPH患者膀胱逼尿肌注射BoNT/A療效更顯著[17]。關(guān)于BoNT/A治療BPH伴排尿功能障礙的Ⅲ期臨床試驗表明，注射BoNT/A后患者尿道阻力顯著改善，其療效優(yōu)于安慰劑治療[4]。

2.1誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡 一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，13例BPH患者在注射200 U BoNT/A 2個月后癥狀改善，且癥狀評分、血清PSA水平均降低，而3例注射0.9%氯化鈉注射液的BPH患者癥狀評分和血清PSA水平均無顯著變化[18]。在超聲引導(dǎo)下，給予32例BPH患者注射200 U BoNT/A，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療1個月后，臨床癥狀及殘余尿量、PSA水平、前列腺體積均顯著改善，且在治療后6個月達到最佳水平，BoNT/A的癥狀改善作用持續(xù)了至少1年[19]。對于藥物治療失敗、不適合或拒絕手術(shù)的45例BPH患者，經(jīng)直腸超聲法注射100 U BoNT/A至患者前列腺基底區(qū)和中段過渡區(qū)，結(jié)果顯示國際前列腺癥狀量表評分降低，排尿后殘余尿量減少，前列腺體積顯著減小，下尿路癥狀顯著改善[20]。在超聲引導(dǎo)會陰注射BoNT/A的77例BPH患者中，治療1個月后，41例患者主觀癥狀緩解；治療2個月后，55例患者主觀癥狀緩解；且與基線相比，患者美國泌尿外科學(xué)會評分、血清PSA水平、殘余尿量降低，前列腺體積減小，平均峰值尿流率升高[21]。

BoNT/A可通過促進前列腺組織細胞凋亡減小前列腺體積。在前列腺增生模型大鼠的前列腺注射BoNT/A，前列腺的實際重量降低32.5%，回歸到正常前列腺重量水平[22]。有實驗證明，前列腺增生大鼠前列腺重量減少是注射BoNT/A誘導(dǎo)前列腺組織細胞凋亡的結(jié)果，且隨著注射劑量的增加，前列腺腺體的重量不斷降低；同時，注射BoNT/A的前列腺增生大鼠B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)基因表達下調(diào)，細胞表面死亡受體Fas和胱天蛋白酶(caspase)3表達上調(diào)[23]。在細胞凋亡過程中，Bcl-2家族成員和Fas/Fas配體信號通路起重要作用，而caspase-3是哺乳動物細胞凋亡通路的關(guān)鍵死亡蛋白酶。在大鼠前列腺內(nèi)注射BoNT/A后發(fā)現(xiàn)，前列腺上皮細胞Bcl-2樣蛋白1表達下調(diào)，caspase-3和Bcl-2相關(guān)X蛋白表達上調(diào)[24]。Bcl-2相關(guān)X蛋白屬于Bcl-2基因家族，具有促進細胞凋亡的功能。但BoNT/A誘導(dǎo)前列腺細胞凋亡的具體機制目前尚不明確。

2.2抑制前列腺組織血管形成 BoNT/A還可抑制前列腺組織血管形成。前列腺增生組織的血管增生多分布于內(nèi)腺以及增生結(jié)節(jié)的內(nèi)部和周邊的前列腺間質(zhì)。在大鼠前列腺內(nèi)注射BoNT/A可通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長因子的表達，抑制前列腺組織的血管形成，促使前列腺體積縮小[25]。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌獲得的放療抵抗特性與缺氧誘導(dǎo)因子-1α具有的細胞修復(fù)和細胞增殖能力有關(guān)[26]。

2.3調(diào)控生長因子 BoNT/A對生長因子具有調(diào)控作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)主要聚集在前列腺基質(zhì)，其對前列腺上皮細胞具有負調(diào)控作用，TGF-β1水平升高可抑制細胞增殖，而水平降低可促進細胞增殖[27]。在其他生長因子存在時，TGF-β1不會導(dǎo)致細胞凋亡，但可使細胞生長增殖停止[28]。堿性成纖維細胞生長因子可以濃度依賴的方式促進增生前列腺間質(zhì)細胞增殖，并抑制平滑肌細胞增殖，故TGF-β1/堿性成纖維細胞生長因子比例失調(diào)是前列腺增生的重要發(fā)病機制[29]。在Wistar大鼠增生的前列腺組織中注射BoNT/A后，TGF-β1的表達上調(diào)，堿性成纖維細胞生長因子的表達下調(diào)，前列腺組織細胞凋亡增加[30]。與正常組織相比，增生前列腺組織中的成纖維細胞生長因子水平顯著升高，而成纖維細胞生長因子可促進上皮細胞和間質(zhì)細胞生長[31]。另有研究發(fā)現(xiàn)，BoNT/A可抑制成纖維細胞增殖，同時還可促進其凋亡，從而減弱成纖維細胞生長因子對前列腺組織的增生作用[32]。而BoNT/A對成纖維細胞生長因子的抑制作用可能與c-Jun氨基端激酶磷酸化水平升高有關(guān)[33]。

3 BoNT/A在前列腺炎中的應(yīng)用

前列腺炎是一種常見的前列腺疾病，主要癥狀為尿道刺激癥狀和慢性盆腔疼痛。前列腺炎分為4型：Ⅰ型前列腺炎為急性細菌性前列腺炎，Ⅱ型前列腺炎為慢性細菌性前列腺炎，Ⅲ型前列腺炎為慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征，Ⅳ型前列腺炎為無癥狀性前列腺炎。BoNT/A對慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征具有較好的療效。

3.1抑制前列腺平滑肌收縮 部分前列腺炎患者抗菌、抗炎藥物治療效果不佳。臨床上已將α受體阻滯劑用于前列腺炎的治療，通過松弛前列腺等部位的平滑肌緩解前列腺內(nèi)尿液反流，減輕炎癥癥狀。Maria等[34]首次應(yīng)用BoNT/A注射治療慢性前列腺炎發(fā)現(xiàn)，BoNT/A的作用主要為抑制前列腺平滑肌收縮。在犬前列腺注射200 U BoNT/A后，其前列腺基質(zhì)組織平滑肌收縮水平顯著降低，同時不影響前列腺的松弛反應(yīng)[35]。

3.2抑制神經(jīng)肽釋放 Wang等[36]建立Wistar大鼠慢性單關(guān)節(jié)炎模型，經(jīng)BoNT/A治療后發(fā)現(xiàn)，大鼠軟骨退變和炎癥細胞浸潤均減輕，提示BoNT/A在抗神經(jīng)性炎癥治療中發(fā)揮重要作用，其原因可能為注射BoNT/A可抑制傷害性神經(jīng)肽的釋放，從而起鎮(zhèn)痛作用。一項雙盲研究將60例慢性前列腺炎患者隨機分為BoNT/A治療組和安慰劑組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與安慰劑組相比，BoNT/A治療組患者的排尿障礙顯著改善，且治療后的1、3、6個月，疼痛亞量表評分較基線分別降低64.76%、75.63%和79.97%，視覺模擬評分分別降低62.3%、72.4%和82.1%，同時慢性前列腺炎癥狀評分、美國泌尿外科學(xué)會評分、晝尿頻率、夜尿頻率均較基線值顯著降低[9]。另一項無對照、隨機試驗比較了63例慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征男性患者經(jīng)尿道和經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)下注射BoNT/A的療效，結(jié)果顯示，治療6個月后，患者的最大尿流量均顯著改善，其中28例經(jīng)尿道注射BoNT/A的患者生活質(zhì)量和疼痛均有所改善，35例經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)下注射BoNT/A的患者慢性前列腺炎癥狀指數(shù)顯著降低，但疼痛改善不明顯[37]。有學(xué)者對13例慢性盆腔疼痛綜合征患者進行會陰注射BoNT/A治療，結(jié)果顯示均未出現(xiàn)不良反應(yīng)和并發(fā)癥，且緩解疼痛效果顯著[38]。對于成年男性Ⅲ型非細菌型慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者給予BoNT/A治療后，前列腺疼痛顯著減輕，且BoNT/A可有效阻斷疼痛感受在盆底功能障礙中的傳導(dǎo)9～12個月[39]。BoNT/A在改善前列腺炎患者疼痛方面效果顯著，同時對于炎癥的緩解也至關(guān)重要。

3.3調(diào)控環(huán)加氧酶2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)的表達 有學(xué)者通過注射辣椒素建立非細菌型前列腺炎大鼠模型發(fā)現(xiàn)，其COX-2水平升高，而注射BoNT/A的大鼠COX-2水平顯著降低；BoNT/A預(yù)處理可減少辣椒素引起的疼痛行為和炎癥反應(yīng)，且呈劑量依賴性，注射BoNT/A可有效改善大鼠的前列腺炎癥狀[40]。COX-2與許多涉及組織炎癥和疼痛的病理生理過程有關(guān)，并可誘導(dǎo)前列腺素合成，尤其是前列腺素E2的合成[41]。有實驗證明，BoNT/A可顯著降低小鼠的前列腺素E2水平[42]。一項關(guān)于大鼠關(guān)節(jié)炎疼痛的實驗發(fā)現(xiàn)，BoNT/A可抑制重要炎癥介質(zhì)(腫瘤壞死因子-α)的釋放，通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥而減輕疼痛[43]。但BoNT/A是否直接調(diào)控COX-2的表達以及是否參與調(diào)控其他炎癥分子的表達均還需進一步研究。

4 BoNT/A在前列腺癌中的應(yīng)用

4.1抑制其他癌細胞的作用 BoNT/A能夠抑制癌細胞的生長，包括乳腺癌細胞、胃癌細胞等。實驗發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺細胞MCF10A相比，BoNT/A對乳腺癌細胞的細胞毒性更強，其可誘導(dǎo)T47D乳腺癌細胞系caspase-3和caspase-7依賴性死亡[44]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在胃的迷走神經(jīng)注射BoNT/A可顯著降低腫瘤的發(fā)生率和延緩腫瘤進展。體外實驗發(fā)現(xiàn)，BoNT/A對胃癌細胞BGC-823和MGC-803增殖均有抑制作用，且增加劑量和作用時間其抑制作用更顯著[45]。

4.2促進前列腺癌細胞凋亡 在原位前列腺腫瘤的瘤體內(nèi)注射BoNT/A后，腫瘤體積縮小，但這種效果維持不超過8個月，且僅局限于晚期前列腺癌[46]，可能與BoNT/A對前列腺癌細胞的表觀遺傳修飾有關(guān)。另外，BoNT/A可在一定程度上促進前列腺癌細胞凋亡。體內(nèi)和體外試驗均發(fā)現(xiàn)，BoNT/A可降低人前列腺癌細胞系LNCaP的增殖并促進其凋亡，但對激素非依賴性前列腺癌細胞系PC-3則無顯著影響；LNCaP細胞和PC-3細胞均表達BoNT/A的蛋白受體SV2，但LNCaP中的SV2數(shù)量約為PC-3的4倍，可能與BoNT/A進入細胞的量有關(guān)[47]。研究發(fā)現(xiàn)，在BoNT/A處理后96 h，LNCaP細胞生長減少了20%，PC-3細胞生長減少了25%，且在LNCaP和PC-3細胞中檢測到SV2，提示BoNT/A可能通過SV2受體進入前列腺癌細胞，因此SV2作為BoNT/A受體可能成為一個抗腫瘤靶點；另外，BoNT/A誘導(dǎo)的細胞溶質(zhì)型磷脂酶A2亞型磷脂酶A2-α磷酸化形式的增加可能是抑制前列腺癌細胞生長的一種機制[48]。BoNT/A對前列腺癌細胞增殖具有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，前列腺癌細胞DU145在劃痕實驗中的遷移能力明顯受到抑制，經(jīng)BoNT/A處理后DU145中的p53表達水平顯著升高[49]，因此BoNT/A可能是潛在的抗癌候選藥物。

4.3神經(jīng)支配 神經(jīng)支配是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，雙側(cè)去神經(jīng)支配可降低小鼠腫瘤的發(fā)生率和減小腫瘤體積；在人前列腺單側(cè)注射BoNT/A后，癌細胞凋亡顯著增加[50]。人的前列腺受自主神經(jīng)系統(tǒng)支配，M受體定位于前列腺，M3受體可促進前列腺癌細胞的增殖[51]。經(jīng)BoNT/A處理后，乙酰膽堿受體M3的轉(zhuǎn)錄水平降低[52]，提示BoNT/A可能通過去神經(jīng)作用控制前列腺癌的進展。

5 小 結(jié)

注射BoNT/A治療前列腺疾病(BPH、前列腺炎等)具有一定的臨床療效。且對于無法手術(shù)、不能忍受長期服藥或經(jīng)手術(shù)藥物療法癥狀無顯著改善的患者，注射BoNT/A治療是一個很好的選擇。BoNT/A可通過促進前列腺增生組織細胞凋亡、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及鎮(zhèn)痛而發(fā)揮作用。但BoNT/A對于前列腺疾病甚至泌尿外科疾病是否具有更顯著的療效，還需進行更多的臨床探索，包括利用分子生物學(xué)技術(shù)進行多種肉毒毒素蛋白的融合和突變等。未來繼續(xù)深入研究BoNT/A治療前列腺疾病的機制不僅可優(yōu)化前列腺疾病的治療，為前列腺癌治療提供新思路和方法，還可擴大臨床應(yīng)用范圍，拓展更多的新型治療藥物。