徐雨昕，季靜靜，張巧艷，秦路平，張泉龍

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源教研室，杭州 311402)

生物活性小分子的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)鑒定和分子作用機(jī)制的闡明是藥理學(xué)與毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。明確化合物的作用靶點(diǎn)是藥物研發(fā)的關(guān)鍵步驟，有助于闡明其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)可能的毒性機(jī)制，并有針對性地進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和改造。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，新的藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，各有優(yōu)勢。如以化合物為中心的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)(compound-centric chemical proteomics,CCCP)、基于活性的蛋白質(zhì)分析(activity-based protein profiling,ABPP)[1]等方法，但這些方法需要對化合物進(jìn)行標(biāo)記，易導(dǎo)致化合物活性減弱或阻礙化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合。近年來，基于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性變化的生物物理學(xué)方法開發(fā)了無需對小分子化合物進(jìn)行改造的靶標(biāo)篩選技術(shù)，如基于蛋白酶解穩(wěn)定性開發(fā)的依賴于靶點(diǎn)穩(wěn)定性的藥物親和反應(yīng)(drug affinity responsive target stability，DARTS)技術(shù)，以及根據(jù)蛋白質(zhì)氧化穩(wěn)定性開發(fā)的基于氧化速率的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測試(stability of proteins from rates of oxidation，SPROX)技術(shù)，用于化合物蛋白質(zhì)靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)，但由于技術(shù)限制，這些技術(shù)尚未得到廣泛使用。

細(xì)胞熱遷移分析(cellular thermal shift assay，CETSA)技術(shù)是近年來開發(fā)的一種新型藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)技術(shù)，其原理是當(dāng)靶蛋白與藥物分子結(jié)合時(shí)，靶蛋白通常會(huì)變得穩(wěn)定，不容易被熱變性[2]。CETSA技術(shù)無需任何蛋白質(zhì)或小分子標(biāo)記，可用于研究小分子對全細(xì)胞裂解物、細(xì)胞及組織中蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性影響。早期CETSA技術(shù)用于鑒定預(yù)知可能的靶蛋白，并且一次只能檢測少量蛋白質(zhì)，但隨著CETSA技術(shù)與高分辨質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合，可以在沒有任何預(yù)知的情況下識(shí)別多個(gè)靶蛋白，并且允許研究者在短時(shí)間內(nèi)研究擾動(dòng)對數(shù)千種單個(gè)蛋白質(zhì)的影響。本文重點(diǎn)討論CETSA技術(shù)的原理、方法及其在藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 CETSA技術(shù)的原理及方法演變

瑞典Karolinska研究所團(tuán)隊(duì)依據(jù)蛋白質(zhì)和藥物結(jié)合時(shí)熱穩(wěn)定性有所提高的特征，首次開發(fā)了一種稱為CETSA的實(shí)驗(yàn)方法[2]，可以直接在細(xì)胞或組織內(nèi)檢測藥物和靶標(biāo)蛋白的結(jié)合親和力，為直接在細(xì)胞或組織內(nèi)檢測藥物和靶標(biāo)蛋白的相互作用、跟蹤藥物的遷移、脫靶效應(yīng)以及耐藥性開辟了一條新途徑。該方法主要包括以下步驟：(1)樣品準(zhǔn)備；(2)藥物干預(yù)；(3)熱反應(yīng)；(4)蛋白質(zhì)提??；(5)蛋白質(zhì)鑒定;(6)數(shù)據(jù)處理。見圖1。

圖1 細(xì)胞熱遷移分析(CETSA)的操作流程圖

1.1 樣品準(zhǔn)備 細(xì)胞裂解液、完整細(xì)胞或組織樣品均可用于CETSA實(shí)驗(yàn)。采用細(xì)胞裂解液處理可用于發(fā)現(xiàn)藥物直接作用的靶標(biāo)蛋白；采用完整細(xì)胞處理可同時(shí)發(fā)現(xiàn)藥物作用細(xì)胞的直接靶點(diǎn)及其下游效應(yīng)蛋白。細(xì)胞裂解液實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞先裂解，后熱處理；完整細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是先熱處理，后裂解。如抗菌藥TH1579能夠穩(wěn)定MTH1蛋白。然而，在完整細(xì)胞，TH1579還能夠穩(wěn)定脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase，dCK)，一種從降解DNA中回收脫氧核苷的酶。其原因?yàn)镸TH1抑制劑能夠促進(jìn)DNA損傷，導(dǎo)致脫氧核苷蓄積，引起dCK熱穩(wěn)定[3]。

1.2 藥物干預(yù)和熱處理 藥物干預(yù)可以采用單一濃度或梯度濃度。單一濃度的藥物干預(yù)后，采用一系列梯度溫度進(jìn)行熱遷移，稱為熱遷移分析實(shí)驗(yàn)，能夠檢測出一個(gè)化合物的主要靶標(biāo)。如采用該方法能夠發(fā)現(xiàn)十字孢堿抑制的49個(gè)激酶(已知66個(gè))[4]，經(jīng)過熱遷移分析，這些激酶的熱遷移值(Tm,即某種蛋白質(zhì)絕對量減少一半時(shí)的溫度)遷移度均>1 ℃。但Tm的大小并不能代表配體與激酶的親和力，因?yàn)門m的改變一方面受配體與激酶的親和力影響，另一方面還由激酶自身的熱穩(wěn)定性決定。

為評(píng)價(jià)配體與激酶的親和力，可采用等溫劑量反應(yīng)(isothermal dose-response,ITDR)分析。該方法采用一系列梯度濃度藥物干預(yù)細(xì)胞，并加熱到一個(gè)恒定的溫度進(jìn)行。K562細(xì)胞提取物與一系列濃度的GSK3182571反應(yīng)，加熱至53 ℃進(jìn)行等溫劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，其測得的親和度與Kinobeads競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間表現(xiàn)出良好的一致性[4]。

二維蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性分析(two-dimensional thermal proteome profiling,2D-TPP)是近年來新出現(xiàn)的技術(shù)[5]。該方法中細(xì)胞與一系列濃度的化合物反應(yīng)，同時(shí)采用不同溫度進(jìn)行熱處理，從而使靶標(biāo)識(shí)別的分辨率更加靈敏，化合物與靶標(biāo)的親和力測定更加快捷。2D-TPP可以使藥物干預(yù)組與未干預(yù)組在同一質(zhì)譜條件下進(jìn)行定量，得到更加精確的量化指標(biāo)，同時(shí)增加了在不同濃度下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性考察，增加了對數(shù)據(jù)的質(zhì)控，過濾了假陽性結(jié)果。Becher等[5]首次采用2D-TPP發(fā)現(xiàn)了panobinostat的脫靶(off-target)苯丙氨酸羥化酶。

1.3 可溶性蛋白質(zhì)的提取 根據(jù)CETSA的原理，藥物與靶標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)變得穩(wěn)定，經(jīng)過熱處理后，孵育體系中蛋白質(zhì)與配體(如藥物分子)結(jié)合后仍保持折疊狀態(tài)，變得相對穩(wěn)定,而沒有結(jié)合配體的蛋白質(zhì)會(huì)解折疊，從而迅速變性、聚集產(chǎn)生沉淀。這些不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)經(jīng)低溫超速離心(相對離心力1.0×104×g～1.0×105×g)可以去除。該過程中裂解液的選擇尤為關(guān)鍵，裂解液的作用是為了提取細(xì)胞中更多的蛋白質(zhì)，同時(shí)使蛋白質(zhì)在整個(gè)處理過程中變得穩(wěn)定。常用的裂解液包括加有混合蛋白酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)裂解液，非變性裂解液[pH 7.5，含0.05 mol/L N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)，0.005 mol/L β-甘油磷酸鈉,0.000 1 mol/L Na3VO4,0.01 mol/L MgCl2,0.002 mol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP),蛋白酶抑制劑]。在最初的操作規(guī)程中，膜蛋白因其不溶性而未能得到分析。為獲取膜蛋白，可在裂解液中添加0.4%NP-40。NP-40是一種能溶解膜蛋白的洗滌劑，不影響細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)成分的溶解性。同時(shí)添加0.4% NP-40不改變細(xì)胞中蛋白質(zhì)的Tm[6]。Reinhard等[6]在CETSA實(shí)驗(yàn)中將含0.4% NP-40的PBS作為裂解液，發(fā)現(xiàn)過釩酸鈉作用于膜蛋白CD45及其下游通路。Hashimoto等[7]采用CETSA技術(shù)篩選膜蛋白-人溶質(zhì)載體家族16成員1(SLC16A1)的抑制劑，0.5%十二烷基-β-D-麥芽糖苷也被用于膜蛋白裂解液，其對SLC16A1的穩(wěn)定性優(yōu)于NP-40裂解液。

1.4 蛋白質(zhì)鑒定 早期CETSA技術(shù)更多通過免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于靶標(biāo)驗(yàn)證工作,因此必須依賴合適的目標(biāo)靶蛋白抗體,無法預(yù)測未知靶蛋白。隨著平行多通道定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(iTRAQ/TMT)的發(fā)展,來自歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Savitski研究組將CETSA技術(shù)與高分辨質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，推出一種全新的基于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的高通量靶標(biāo)篩選方法——蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性分析(thermal proteome profiling,TPP)技術(shù)，又名MS-CETSA[4]。該技術(shù)具有無偏見性、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。TPP技術(shù)通過對經(jīng)熱處理后獲得的可溶蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，并對肽段進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記，將不同溫度處理的樣品混合后進(jìn)行離線肽段分級(jí),最后利用定量質(zhì)譜分析肽段的相對含量并得到每個(gè)蛋白質(zhì)在小分子處理組和對照組的熱熔曲線，通過擬合熱熔曲線計(jì)算蛋白質(zhì)的Tm。TPP法主要為獲取不同溫度、不同濃度或不同細(xì)胞狀態(tài)條件下蛋白質(zhì)的變化趨勢，計(jì)算蛋白質(zhì)熱熔曲線、Tm值、pEC50值(半數(shù)最大有效濃度的對數(shù)值)等，亦有通過計(jì)算熱遷移面積f(T)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)熱遷移的報(bào)道[8]。常用的數(shù)據(jù)處理R軟件包包括：mineCETSA[8]、TPP[9]、mstherm (https://CRAN.R-project.org/package=mstherm)。

此外，Park 研究組開發(fā)了一種基于二維熒光凝膠差異的熱穩(wěn)定性分析技術(shù)(thermal stability shift-based fluorescence difference in two-dimensional gel electrophoresis,TS-FITGE)[10]。該方法在熱處理并高速離心獲得可溶性蛋白質(zhì)后，將不同熒光標(biāo)記試劑分別加入對照組(Cy3,綠色)和實(shí)驗(yàn)組(Cy5,紅色)。將相同處理溫度的實(shí)驗(yàn)組和對照組物質(zhì)混合并進(jìn)行二維電泳,再經(jīng)圖像自動(dòng)處理可以得到混合點(diǎn)的兩種熒光標(biāo)記的比值并定量。與采用TMT標(biāo)記的TPP方法相比,TS-FITGE 技術(shù)的最大優(yōu)勢在于無需使用成本較高的穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑，在發(fā)現(xiàn)目標(biāo)候選物上存在互補(bǔ)性，但從操作方法和數(shù)據(jù)分析上，TPP法更為簡便、靈敏，可直接完成目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量定性分析。CETSA及TPP的應(yīng)用情況見表1[2,4-6,8,11-20]。

2 CETSA技術(shù)在藥理學(xué)與毒理學(xué)中的應(yīng)用

2.1 藥物靶標(biāo)的確證及藥物親和力分析 CETSA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可以從細(xì)胞裂解液、活細(xì)胞或組織中驗(yàn)證藥物與靶蛋白的相互作用。通過藥物濃度的遞增或熱反應(yīng)溫度的梯度遞增，結(jié)合Western blot技術(shù)檢測靶蛋白的熱熔曲線及等溫劑量反應(yīng)曲線評(píng)價(jià)藥物與靶蛋白的結(jié)合力。近年來，將CETSA技術(shù)與高內(nèi)涵影像(high content imaging)[21]、高內(nèi)涵免疫熒光檢測(high content immunofluorescent，HCIF)[22]、 分裂納米熒光素酶法(split nano luciferase approach，SplitLuc)[23]、 Nanoluc檢測法[24]等方法相結(jié)合，開發(fā)出一系列高通量藥物靶點(diǎn)篩選方法，已成功用于p38α抑制劑[25]、B-Raf和聚(ADP-核糖)聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1)蛋白抑制劑[26]、雄激素受體藥物親和力[27]、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase,CDK2)抑制劑[23]的篩選研究。

表1 CETSA及TPP的應(yīng)用情況匯總

2.2 藥物脫靶的發(fā)現(xiàn) 藥物脫靶效應(yīng)即藥物設(shè)計(jì)之外的額外靶點(diǎn)，是導(dǎo)致藥物副作用的主要原因。Savitski等[4]采用TPP法發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)蛋白酶抑制劑(如絲氨酸酶抑制劑維羅非尼，間變性淋巴瘤激酶抑制劑阿來替尼)中與毒性相關(guān)的脫靶——亞鐵螯合酶(ferrochelatase)。亞鐵螯合酶是血紅素生物合成中的末端酶，已知該酶的失活變性會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞生成性原卟啉癥，從而導(dǎo)致肝損傷和嚴(yán)重的光敏反應(yīng)。這也是維羅非尼產(chǎn)生光敏性副作用的原因。

2016年，Becher等[5]采用2D-TPP法研究抗癌藥物組胺去乙酰化抑制劑帕比司他(panobinostat)，除了已知靶點(diǎn)外，還發(fā)現(xiàn)了一些未知靶點(diǎn)，如苯丙氨酸羥化酶[5]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)帕比司他能增加細(xì)胞內(nèi)苯丙氨酸的濃度，減少酪氨酸生成，這與其有效抑制苯丙氨酸羥化酶相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為解釋臨床患者使用帕比司他后出現(xiàn)甲狀腺激素水平降低的不良反應(yīng)提供了理論依據(jù)。

2.3 病原菌藥物靶點(diǎn)的確證 TPP可用于研究細(xì)菌細(xì)胞中大多數(shù)蛋白質(zhì)的活性和結(jié)構(gòu)，以及藥物對細(xì)菌的影響。Mateus等[15]將MS-CETSA(又名TPP)法成功用于考察大腸桿菌(Escbericbiacoli)的生長周期變化及抗菌藥物的分子作用機(jī)制，在細(xì)胞裂解液及活細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了氨芐西林的作用靶點(diǎn)青霉素結(jié)合蛋白家族成員(MrcA、DacB等)，并且發(fā)現(xiàn)氨芐西林耐受的β-內(nèi)酰胺酶AmpC也是氨芐西林的作用靶點(diǎn)。

Dziekan等[17]利用MS-CETSA法對人瘧疾的主要致病原惡性瘧原蟲進(jìn)行了藥物靶向鑒定，發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲嘌呤核苷磷酸化酶(Plasmodiumfalciparumpurine nucleoside phosphorylase，PfPNP)是抗瘧藥物奎寧和甲氟喹的共同結(jié)合靶點(diǎn)。

2.4 細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的發(fā)現(xiàn) 三磷酸核苷酸(nucleosides triphosphate，NTPs)在細(xì)胞的生化過程中起著非常重要的作用，三磷酸腺苷(adenosine triphophate，ATP)是細(xì)胞中最豐富的NTPs。Sridharan等[28]利用CETSA法與多重定量質(zhì)譜相結(jié)合，通過設(shè)置一系列ATP濃度及溫度處理細(xì)胞，在蛋白質(zhì)層面上得到ATP相關(guān)二維熱蛋白質(zhì)圖譜，從而揭示蛋白質(zhì)組中ATP濃度依賴性的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

蛋白質(zhì)之間的相互作用在不同的細(xì)胞狀態(tài)和條件下是不斷變化的，由蛋白質(zhì)相互作用形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物在細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用。Tan等[29]利用多維TPP法分析細(xì)胞中的蛋白質(zhì)復(fù)合物發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化。其利用多維TPP法確定上千種蛋白質(zhì)的熱熔曲線，然后基于這些熱熔曲線之間的相似性，采用熱鄰近共聚合(thermal proximity coaggregation，TPCA)技術(shù)高通量監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)復(fù)合物動(dòng)力學(xué)。這種方法在很多已知的蛋白質(zhì)復(fù)合物中得到驗(yàn)證，可用來高通量地監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)復(fù)合物動(dòng)態(tài)變化。這些研究人員利用TPCA法鑒定出很多沒有差異性蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)復(fù)合物，如在細(xì)胞周期的S期受到調(diào)節(jié)的染色質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)合物。他們還利用這種方法鑒定出6種細(xì)胞系中的細(xì)胞特異性的蛋白質(zhì)相互作用，凸顯了此方法鑒定受到疾病影響的蛋白質(zhì)復(fù)合物的潛力。

3 小結(jié)和展望

目前，CETSA技術(shù)與高分辨質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)成功應(yīng)用于大腸桿菌、人類細(xì)胞、植物等多種生物體的研究，藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)及細(xì)胞內(nèi)代謝物與蛋白質(zhì)相互作用的研究。最新研究已將TPP法成功用于在體組織藥物靶標(biāo)確證[30]。此外，TPP技術(shù)還用于植物溫度脅迫響應(yīng)對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響，為解析植物熱響應(yīng)開辟了新渠道[31]。廣義來說， MS-CETSA技術(shù)為從細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究外界及內(nèi)部因素對細(xì)胞或組織的擾動(dòng)提供了新的機(jī)會(huì),但還面臨以下挑戰(zhàn)：(1)蛋白質(zhì)覆蓋率。目前CETSA技術(shù)適用于細(xì)胞中可溶性蛋白質(zhì)的相互作用研究，但不適用于細(xì)胞膜上的水不溶性蛋白質(zhì)。盡管加入NP-40或十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM)能夠提高膜蛋白質(zhì)的溶解度，但其對蛋白質(zhì)的活性及藥物響應(yīng)性的影響有待進(jìn)一步研究。因此，采用合適的裂解液或者載體來提高細(xì)胞蛋白質(zhì)與藥物的反應(yīng)率及檢出率是亟待解決的問題之一。(2)熱鄰近共聚合的影響。細(xì)胞中存在多種蛋白質(zhì)復(fù)合物，其由多個(gè)亞基組成，這些亞基具有熱鄰近共聚合現(xiàn)象。一個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物中有一個(gè)最不耐熱的亞基，當(dāng)配體與該亞基結(jié)合后變得熱穩(wěn)定，從而導(dǎo)致其他與之聚合的亞基也變得熱穩(wěn)定，產(chǎn)生熱遷移，增加了假陽性的發(fā)生率。目前采用多維度MS-CETSA方法，有助于發(fā)現(xiàn)熱鄰近共聚合現(xiàn)象，提高蛋白質(zhì)靶標(biāo)檢測的靈敏度和靶標(biāo)準(zhǔn)確性。綜上所述，CETSA技術(shù)與多種檢測分析技術(shù)相結(jié)合，有助于高通量鑒定藥物的靶標(biāo)蛋白，以及實(shí)現(xiàn)化合物靶標(biāo)及脫靶效應(yīng)研究的無偏見性。