黃 彪，蔡方超，趙 鑫，曹永兵，周婷婷，范國(guó)榮*

[1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海 200433；2.科文斯醫(yī)藥研發(fā)(上海)有限公司生物分析部，上海 201203]

紅景天主要生長(zhǎng)于海拔約4000米的巖石或冰川中，因此被譽(yù)為“高原人參”。目前的研究結(jié)果顯示，紅景天及其活性成分在抗疲勞，抗氧化，保護(hù)心血管、肝腎功能及抗癌，抗抑郁方面均有很好的功效，有增強(qiáng)機(jī)體機(jī)能和提高免疫力等作用[1-3]。近年來(lái),對(duì)于紅景天苷的國(guó)內(nèi)外研究多集中于其功效方面，體內(nèi)藥物含量測(cè)定多以大鼠為研究對(duì)象[4-6]。在測(cè)定比格犬體內(nèi)紅景天苷和酪醇含量的研究報(bào)道中，未見(jiàn)對(duì)其生物利用度的考察，且檢測(cè)方法靈敏度較低[7-8]，不足以支持其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。

本研究建立了準(zhǔn)確、靈敏、高效的LC-MS/MS法，用于測(cè)定比格犬血漿中紅景天苷及其主要代謝物酪醇的含量。血漿樣品預(yù)處理在常規(guī)萃取溶劑氯仿中添加苯酚(除蛋白質(zhì))和異戊醇(促進(jìn)苯酚和氯仿互溶)，使得一步萃取能同時(shí)達(dá)到蛋白質(zhì)沉淀和液-液萃取的目的，為藥物臨床審批和后續(xù)臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器 Triple quad 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Shimadzu LC30島津液相色譜系統(tǒng)(日本島津儀器有限公司);Elma sonic P 300H超聲波清洗器(德國(guó)埃爾瑪公司)；XPR6UD5和XPE205型高精準(zhǔn)度電子天平(精度0.5 μg，瑞士梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司)。

1.2 藥品和試劑 紅景天苷對(duì)照品(純度99.0%，批號(hào)20180901)由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室提供；酪醇對(duì)照品(純度98.0%，批號(hào)A1015AS)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；天麻素對(duì)照品(純度98.9%，批號(hào)14031921)購(gòu)自上海同田生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；氨水、氯仿、苯酚和異戊醇等其他試劑均為分析純；超純水(本教研室用MilliQ純水儀自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 選擇Shimadzu Shim-pack Velox PFPP色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以水(A相)含20%乙腈的甲醇溶液(B相)為流動(dòng)相梯度洗脫(0～1 min,12%B;1～2.5 min,12%～85%B;2.5～3.5 min,85%B;3.5～3.6 min,85%～12%B;3.6～5 min,12%B)，流速0.3 ml/min；柱溫40 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為5 ℃；進(jìn)樣量為2 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子(ESI)源，負(fù)離子模式檢測(cè)；源噴射電壓為-4500 V；去溶劑溫度為550 ℃；霧化器(GS1)和輔助加熱氣(GS2)分別為75 psi(1 psi=6.894 76 Pa)和60 psi；氣簾氣體模式的壓力為35 psi；入口電壓(EP)為10 V；碰撞室出口電壓(CXP)為14 V；掃描方式選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，掃描時(shí)長(zhǎng)為100 ms。離子監(jiān)測(cè)通道分別為m/z299.1→118.9(紅景天苷)、m/z137.0→105.9(酪醇)和m/z285.1→122.9(內(nèi)標(biāo)天麻素)。紅景天苷、酪醇和天麻素的去簇電壓分別為-70 eV、-100 eV和-40 eV，碰撞能量分別為-19 eV、-22 eV和-17 eV。

2.2 溶液的配制 分別精密稱取紅景天苷和酪醇對(duì)照品各兩份，溶解于40%乙腈溶液，定容，得到濃度均為0.4 mg/ml的紅景天苷及酪醇儲(chǔ)備液。用40%乙腈溶液稀釋紅景天苷及酪醇儲(chǔ)備液，得紅景天苷和酪醇濃度分別為0.2、0.4、2、8、32、80、180、200 μg/ml和0.02、0.04、0.2、0.8、3.2、8、18、20 μg/ml的系列對(duì)照品工作液； 紅景天苷和酪醇的濃度分別為0.2、0.6、10、160 μg/ml和0.02、0.06、1、16 μg/ml的質(zhì)控樣品工作液， 于4 ℃保存， 備用。

另外，精密稱取天麻素對(duì)照品一份，溶解于40%乙腈溶液，定容，得濃度為0.1 mg/ml的天麻素對(duì)照品儲(chǔ)備液。用水稀釋得濃度為500 ng/ml的內(nèi)標(biāo)工作液，于4 ℃保存，備用。

2.3 溶血血漿的配制 將新鮮采集的比格犬空白全血放入-70 ℃冰箱冷凍后，經(jīng)至少一次凍融循環(huán)，渦旋3 min，3.5×103×g離心5 min，取上層溶血血漿和常規(guī)血漿按照體積比2∶98進(jìn)行混合，渦旋1 min，制得溶血血漿，于-20 ℃冰箱保存，備用。

2.4 血漿樣品的處理 血漿樣品預(yù)處理選用的液-液萃取溶劑為氯仿、苯酚和異戊醇的混合試劑(體積比為50∶48∶2)。取50 μl比格犬血漿樣品，依次加入50 μl內(nèi)標(biāo)工作液和100 μl濃氨水(28%～32%)，渦旋混合2 min后，超聲5 min。加入300 μl萃取溶劑，渦旋3 min，3.5×103×g離心5 min，加水250 μl，再次渦旋3 min，離心15 min，取上清液300 μl，55 ℃下氮?dú)獯蹈桑尤?50 μl復(fù)溶液(乙腈∶甲醇∶水=2∶8∶90，V∶V)，渦旋后以相對(duì)離心力3.5×103×g離心5 min，取2 μl進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性 分別取6份不同來(lái)源的比格犬空白血漿樣品和用此6份空白血漿配制而成的定量下限(LLOQ)質(zhì)控樣品，評(píng)估不同來(lái)源的空白血漿中內(nèi)源性干擾問(wèn)題。分別取若干份比格犬空白血漿，按照2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，再按2.1項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在本研究設(shè)定的條件下，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)紅景天苷、酪醇和內(nèi)標(biāo)天麻素的測(cè)定不產(chǎn)生干擾。紅景天苷、酪醇、天麻素的出峰時(shí)間分別為2.3、2.6、1.5 min，典型圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 紅景天苷和酪醇的LC-MS/MS譜圖

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測(cè)限 取950 μl比格犬空白血漿樣品，分別加入50 μl對(duì)應(yīng)濃度的紅景天苷及酪醇標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液，得到紅景天苷和酪醇濃度分別為10.0、20.0、100、400、1 600、4 000、9 000、10 000 ng/ml和1.00、2.00、10.0、40.0、160、400、900、1 000 ng/ml的系列對(duì)照血漿樣品，按2.4項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析。將待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(y)作為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)待測(cè)濃度(x，ng/ml)作為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸(加權(quán)相關(guān)系數(shù)為1/x2)，擬合得標(biāo)準(zhǔn)定量曲線。結(jié)果紅景天苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.005 89x+0.025 4(r=0.996 3)；酪醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.002 13x+0.003 84(r=0.998 3)，表明紅景天苷和酪醇分別在10～10 000 ng/ml和1～10 000 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。紅景天苷和酪醇的LLOQ分別為10和1 ng/ml[信噪比(S/N)≥10]，最低檢測(cè)限(LOD)分別為1和0.3 ng/ml(S/N≥3)。

2.5.3 精密度和提取回收率 采用比格犬空白血漿配制LLOQ及低、中、高濃度的紅景天苷和酪醇血漿質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度配制6份樣品，隨行配制并測(cè)定樣品，連續(xù)3 d，計(jì)算質(zhì)控樣品的測(cè)得濃度，以獲得本法的批內(nèi)(日內(nèi))、批間(日間)精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 紅景天苷和酪醇測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度

用比格犬空白血漿配制低、中、高濃度的血漿樣品，按2.4項(xiàng)下方法操作，每個(gè)濃度進(jìn)行6份樣品分析。同時(shí)吸取比格犬空白血漿50 μl，不加內(nèi)標(biāo)溶液(用50 μl純水替代內(nèi)標(biāo)溶液)，其余按2.4項(xiàng)下方法操作，測(cè)定峰面積。用提取后待測(cè)物色譜峰的峰面積與未經(jīng)樣品預(yù)處理的待測(cè)物色譜峰的峰面積比值來(lái)計(jì)算方法的提取回收率。結(jié)果低、中、高濃度紅景天苷的提取回收率分別為91.0%、97.3%和103.6%(n=6)；低、中、高濃度酪醇的提取回收率分別為96.2%、97.5%和100.6%(n=6)?？梢?jiàn)精密度及回收率的測(cè)定結(jié)果符合現(xiàn)行生物分析方法的相關(guān)規(guī)定，可應(yīng)用于比格犬血漿中紅景天苷和酪醇的定量分析。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 取6份不同來(lái)源的比格犬空白血漿和1份空白溶血血漿(50 μl)，用50 μl純水替代內(nèi)標(biāo)工作溶液，按2.4項(xiàng)下操作至氮?dú)獯蹈?，分別添加標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液，使其濃度和低、高濃度質(zhì)控樣品相同，獲取其峰面積(A)，并與相應(yīng)濃度純?nèi)芤悍迕娣e(B)比較，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(MF)。在同一濃度下，基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式為A/B×100%。同時(shí)也對(duì)內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)(分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)比值)進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果在比格犬正常血漿樣品中，紅景天苷低、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為94.9%和97.4%，RSD分別為6.9%和2.4%(n=6)；酪醇低、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為103.4%和95.2%，RSD分別為5.2%和3.0%(n=6)；內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為99.9%，RSD為3.2%(n=12)。在比格犬溶血血漿樣品中，紅景天苷低、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為96.2%和99.4%，RSD分別為8.1%和5.3%(n=6)；酪醇低、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為103.5%和98.0%，RSD分別為5.3%和4.4%(n=6)；內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為92.6%，RSD為7.3%(n=12)。結(jié)果表明，在本研究操作條件下，常規(guī)血漿以及溶血血漿中，待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。

2.5.5 穩(wěn)定性 考察紅景天苷和酪醇儲(chǔ)備液和工作液室溫放置6 h，比格犬血漿樣品在室溫條件下放置24 h，全血質(zhì)控樣品分別于濕冰或室溫條件下放置2 h、經(jīng)液-液萃取處理后于自動(dòng)進(jìn)樣器放置96 h，比格犬血漿樣品分別于-20 ℃和-70 ℃經(jīng)歷5次冷凍-解凍循環(huán)，比格犬血漿樣品于-20 ℃和-70 ℃冷凍35 d的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，紅景天苷和酪醇在上述考察條件中的穩(wěn)定性均符合生物樣品的檢測(cè)要求。

2.5.6 稀釋效應(yīng) 考察超出定量上限的質(zhì)控樣品經(jīng)空白血漿稀釋后的準(zhǔn)確度。取紅景天苷及酪醇的稀釋質(zhì)控樣品(質(zhì)量濃度分別為8 000、80 000 ng/ml)，用空白比格犬血漿將其體積稀釋20倍，按2.4項(xiàng)下操作，進(jìn)行6個(gè)樣本平行分析。結(jié)果表明，經(jīng)空白比格犬血漿稀釋后的質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度良好。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在上海新岡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)進(jìn)行[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0006]。比格犬體質(zhì)量為6～8 kg，24～30周齡，雌雄各半。禁食(自由飲水)12 h后給藥，給藥4 h后允許進(jìn)食。

比格犬口服給藥組(n=6，雌雄各半)紅景天苷給藥劑量為15 mg/kg，口服膠囊1粒，飲用水送服。膠囊裝藥量根據(jù)比格犬實(shí)際體質(zhì)量計(jì)算，即膠囊裝藥量(mg)=體質(zhì)量(kg)×給藥劑量(15 mg/kg)。于給藥前0.5 h內(nèi)采集空白血漿，給藥后即刻，15、30、45 min，1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、16、24 h經(jīng)前肢靜脈取血1 ml，置于肝素鈉抗凝試管中，2.5×103×g(4 ℃)離心10 min分離血漿，于-70 ℃儲(chǔ)存，待測(cè)。

比格犬靜脈注射給藥組(n=6，雌雄各半)紅景天苷給藥劑量為1.5 mg/kg。注射液用生理鹽水配制，統(tǒng)一于左前肢靜脈推注給藥1 ml，注射液濃度根據(jù)比格犬實(shí)際體質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算，即注射液濃度(mg/ml)=體質(zhì)量(kg)×給藥劑量(1.5 mg/kg)/注射液體積(1 ml)。分別于給藥前0.5 h內(nèi)，給藥后即刻，2、5、10、20、30、45 min，1、1.5、2、3、4、6、8、12 h經(jīng)右前肢靜脈取血1 ml，置于肝素鈉抗凝試管中，2.5×103×g(4 ℃)離心10 min，分離血漿，于-70 ℃儲(chǔ)存，待測(cè)。

采用Phoenix WinNonlinR 8.1軟件(美國(guó)Pharsight公司)以非房室模型進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，并繪制其血藥濃度-時(shí)間曲線。比格犬單劑量口服和靜脈注射紅景天苷后體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2，平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。

2.7 絕對(duì)生物利用度 經(jīng)考察，紅景天苷和酪醇在比格犬中的絕對(duì)生物利用度不同性別間不存在顯著差異。劑量歸一化后，紅景天苷和酪醇的絕對(duì)生物利用度分別為33.5%和48.8%。

3 討 論

目前對(duì)紅景天苷的藥動(dòng)學(xué)研究主要集中在大鼠身上，僅有少量在比格犬中的研究，且主要代謝物酪醇鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。以往的研究中，未見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》中針對(duì)生物分析方法驗(yàn)證所要求的特殊基質(zhì)(溶血血漿、高脂血等)基質(zhì)效應(yīng)的考察。因高脂血研究不適用于比格犬，故本研究?jī)H新增紅景天苷和酪醇在溶血血漿中的基質(zhì)效應(yīng)考察。在用LC-MS/MS法檢測(cè)紅景天苷濃度時(shí)，常規(guī)方法中溶血血漿在提取后嚴(yán)重抑制了紅景天苷和酪醇的響應(yīng)，使其無(wú)法準(zhǔn)確定量。本研究采用氯仿、 苯酚和異戊醇混合試劑進(jìn)行液-液萃取的同時(shí)，血漿中蛋白質(zhì)成分也被同時(shí)去除，減少了基質(zhì)對(duì)定量測(cè)定的影響，解決了在溶血血漿中定量不準(zhǔn)確的問(wèn)題。通過(guò)選擇合理的色譜柱和梯度洗脫條件，減少了質(zhì)譜背景干擾對(duì)檢測(cè)限的影響，提高了分析方法的的靈敏度(酪醇最低定量限為1 ng/ml)和分析結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度。

表2 比格犬在單次給藥(口服15 mg/kg或靜脈注射1.5 mg/kg)后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 紅景天苷和酪醇的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

本研究建立的分析方法嚴(yán)格遵守了2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部中生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[9]，為研究紅景天苷及其代謝物酪醇在比格犬中的藥動(dòng)學(xué)提供了技術(shù)參考，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

致謝感謝科文斯醫(yī)藥研發(fā)(上海)有限公司提供分析儀器和檢測(cè)場(chǎng)地！