張闖 江龍委 張燕 艾月琴 史瑞芳 高艷榮 趙華 姚露 賈紹昌 胡建華 肖梅

1.南京市玄武醫(yī)院，江蘇 南京 210000；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，江蘇 南京 210002

腫瘤是威脅人類健康的主要疾病，結(jié)直腸癌是發(fā)病率與死亡率均位居前列的腫瘤。研究顯示，2018 年全世界新發(fā)腫瘤中，結(jié)直腸癌在所有腫瘤中位居第三，而在因腫瘤死亡的病例中，結(jié)直腸癌位居第二；男性中結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率分別位居第三和第四，女性中結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率分別位居第二和第三［1］，結(jié)直腸癌在人類發(fā)展指數(shù)（human development index，HDI）不同的國(guó)家的發(fā)病及死亡情況也有所不同。在HDI 高的國(guó)家中，其發(fā)病率在男性和女性中分別位居第三及第二位，死亡率分別為第四及第三位；而在HDI 低的國(guó)家中，其發(fā)病率在男性和女性中分別位居第五及第三位，死亡率都為第五位［1］。隨著手術(shù)、放化療技術(shù)的發(fā)展，結(jié)直腸癌患者的治愈率及生存時(shí)間都有明顯上升，但對(duì)于晚期結(jié)直腸癌患者而言，生存率并不樂觀［2］。

細(xì)胞免疫治療是一種有潛力的腫瘤治療方法，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer，CIK）是其中一種具有廣譜殺瘤活性的免疫細(xì)胞。CIK 是一群異質(zhì)性細(xì)胞，主要的效應(yīng)細(xì)胞為CD3+CD56+具有自然殺傷細(xì)胞（natural killer，NK）樣特征的T 細(xì)胞。臨床研究證實(shí)，CIK 對(duì)多種腫瘤具有殺傷活性，能使患者臨床獲益［3-9］。CIK 的主要來源是患者自身外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），簡(jiǎn)稱外周血來源 CIK（peripheral derived CIK，PB-CIK）。但是對(duì)于部分健康狀況較差的晚期腫瘤患者或是老年患者而言，獲得足夠數(shù)量的外周血PBMC 比較困難［10］。針對(duì)這種情況，使用臍血來源PBMC 制備CIK（cord blood derived CIK，CB-CIK）用于腫瘤治療是一種可行的方法［11］。本研究探討CB-CIK 與PB-CIK 治療晚期結(jié)直腸癌患者的安全性及有效性，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年10 月至2017 年9 月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)（原第81 醫(yī)院）生物治療科進(jìn)行治療的結(jié)直腸癌患者52 例。按隨機(jī)數(shù)字表法分為 CB-CIK 組和 PB-CIK 組。CB-CIK 組 26 例，采用臍血來源CIK 治療；PB-CIK 組26 例，采用外周血來源CIK 治療。兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中國(guó)結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)診斷確診為結(jié)直腸癌的患者［12］；karnofsky功能狀態(tài)評(píng)分（karnofsky performance status，KPS）≥60分；年齡18～80 歲；預(yù)期生存期≥3 個(gè)月；其他治療結(jié)束至首次細(xì)胞治療開始間隔3 個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重糖尿病、心腦血管疾病患者；嚴(yán)重凝血功能異常者；嚴(yán)重自身免疫性疾病患者；近期內(nèi)有活動(dòng)性出血史者及RH 陰性患者；對(duì)本治療中所用的生物試劑過敏者；無法抽取血液的腫瘤患者；嚴(yán)重精神疾病者；臟器移植者；不可控制的感染性疾病。本臨床試驗(yàn)程序經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，全部入組患者均簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較（例）

1.3 試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自加拿大Stemcell 公司。KBM-551 培養(yǎng)液為美國(guó)Corning 公司產(chǎn)品，抗人CD3 單克隆抗體（anti-CD3 mAb）購(gòu)自北京同立海源生物工程有限公司，重組人IL-1β 購(gòu)自美國(guó)peprotech 公司，重組人IFN-γ 購(gòu)自上海凱茂生物科技有限公司。流式抗體均為beckman 公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀型號(hào)為Beckman 公司的Beckman Coulter XL。

1.4 方法

1.4.1 CIK 細(xì)胞的制備及表型測(cè)定。血液來源：26 例行PB-CIK 治療的患者使用的血液為自體外周血；26 例行CB-CIK 治療的患者使用的臍血均來源于東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院產(chǎn)科足月正常分娩的產(chǎn)婦，按衛(wèi)生部《獻(xiàn)血體檢標(biāo)準(zhǔn)》檢驗(yàn)合格。CIK 的培養(yǎng)：采集的血液分離出PBMC，洗滌后置添加培養(yǎng)液至濃度為2～3×106個(gè)/mL，并加入重組人IFN-γ 至終濃度為1000U/mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。第二天加入終濃度為500U/mL 的rhIL-2 和50ng/mL 的 anti-CD3 mAb 及 4ng/mL 的重組人 IL-1β繼續(xù)培養(yǎng)，定期觀察換液。在第9～21 天檢測(cè)質(zhì)量合格后分3 次收集細(xì)胞。

1.4.2 CIK 細(xì)胞免疫治療方案。視CIK 細(xì)胞成熟情況，共3 次靜脈回輸，每次回輸間隔1 天，細(xì)胞數(shù)不少于1×109個(gè)/mL。以 3 次 CIK 細(xì)胞回輸為 1 治療周期。

1.4.3 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)。在治療前及治療后一周內(nèi)分別抽取外周血進(jìn)行流式檢測(cè)，流式抗體組合為CD3-ECD、CD4-PC5、CD8-FITC、CD19-FITC、CD56-PE、CD25-PE。檢測(cè)結(jié)果用CXP（v2.1）軟件分析。

1.5 療效評(píng)價(jià) 在患者治療前1 周及接受完最后一次治療后三個(gè)月內(nèi)進(jìn)行免疫反應(yīng)及臨床療效評(píng)估，之后每3～6 個(gè)月復(fù)查評(píng)估。評(píng)估指標(biāo)為癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），外周血細(xì)胞因子 IL-2、IFN-γ和TNF-α，外周血淋巴細(xì)胞亞群及影像學(xué)檢查。近期療效評(píng)估按實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）［13］進(jìn)行評(píng)價(jià)。以 CR+PR+SD 計(jì)算疾病控制率（disease control rate，DCR）。細(xì)胞治療過程中的不良反應(yīng)根據(jù)美國(guó)國(guó)立癌癥研究所《常見不良反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)》（NCI-CTCAE v4.0）［14］進(jìn)行判定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（）表示，同一樣本治療前后比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析及增殖能力比較 分別計(jì)數(shù)起始PBMC 的數(shù)量及收獲的CIK 細(xì)胞總數(shù)量，CB-CIK 組和PB-CIK 組患者分離PBMC 均值無顯著差異（P＞0.05）。經(jīng)過 15 天培養(yǎng)后，CB-CIK 組收獲的CIK 細(xì)胞總數(shù)明顯高于PB-CIK 組，表示CB-CIK 的增殖能力強(qiáng)于PB-CIK。見表2。

表2 兩組患者細(xì)胞增殖能力比較

使用流式細(xì)胞儀分析起始PBMC 及收獲的CIK細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示兩組患者PBMC 中CD3+CD56+細(xì)胞的比例都不到1%，而經(jīng)過15天的培養(yǎng)，CB-CIK 組CD3+CD56+細(xì)胞比例顯著高于PB-CIK 組（P＜0.05）。見表 3。

2.2 兩組患者臨床療效比較 兩組DCR 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 4。

表3 兩組患者CIK 細(xì)胞的平均表型（%）

表4 兩組患者臨床療效比較（例）

2.3 兩組患者細(xì)胞免疫治療前后CEA 變化 經(jīng)細(xì)胞治療后，52 例患者的CEA 平均值顯著低于細(xì)胞治療前（P＞0.05）。治療前后兩組患者 CEA 無差異（P＞0.05）。見表5。

2.4 兩組患者細(xì)胞免疫治療前后免疫學(xué)指標(biāo)的變化兩組患者治療前總T 細(xì)胞、輔助性T 細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK 細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞都無顯著性差異（P＞0.05），而治療后也無顯著差異（P＞0.05）。見表 6。

表5 患者細(xì)胞免疫治療前后CEA 變化（μg/L，）

表5 患者細(xì)胞免疫治療前后CEA 變化（μg/L，）

分組 n 治療前 治療后 P總體 52 157.86±248.67 91.68±162.90 0.040 CB-CIK 26 151.92±229.16 89.87±120.52 0.111 PB-CIK 26 164.17±271.16 93.48±199.01 0.177 P 0.251 0.607

兩組患者治療前外周血 IL-2、IFN-γ 和 TNF-α 水平無顯著差異（P＞0.05）。治療后，CB-CIK 組 IL-2 及IFN-γ 水平顯著高于 PB-CIK 組（P＜0.05），TNF-α 水平雖有增高但無顯著差異（P＞0.05）。見圖1。

2.5 兩組患者CIK 治療的安全性分析 兩組患者中，共有5 例在細(xì)胞回輸后出現(xiàn)畏寒和發(fā)熱，其中CB-CIK組有 2 例，PB-CIK 組有 3 例，兩組無顯著差異（P=0.638），對(duì)癥處理后恢復(fù)正常。所有不良反應(yīng)均未達(dá)3～4 級(jí)。

表6 患者治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化（%，）

表6 患者治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化（%，）

淋巴細(xì)胞亞群 治療前 治療后 P CB-CIK 組 PB-CIK 組 CB-CIK 組 PB-CIK 組CD3+ 64.75±8.59 62.82±11.40 64.48±10.02 61.34±15.78 0.564 CD4+ 35.52±7.69 33.15±9.65 33.69±8.87 33.37±12.30 0.941 CD8+ 26.91±8.62 24.38±9.62 29.09±12.74 24.12±9.64 0.280 CD4+/CD8+ 1.53±0.79 1.56±0.83 1.37±0.64 1.48±0.60 0.527 CD3+CD56+ 16.50±10.26 19.05±9.89 17.23±9.74 17.89±12.27 0.941 CD4+CD25+ 3.45±1.24 2.93±0.86 3.85±1.69 3.27±1.51 0.373

圖1 兩組患者治療前后外周血細(xì)胞因子含量的比較

3 討論

臍血在臨床上用于治療腫瘤及非腫瘤的疾病已經(jīng)有幾十年的歷史。臍血具有低免疫原性的特點(diǎn)，即使在供體與配體之間HLA 錯(cuò)配很高的情況下也能耐受臍血移植［15］。研究證明，臍血細(xì)胞移植到腫瘤患者體內(nèi)能產(chǎn)生一定的臨床反應(yīng)且無嚴(yán)重不良反應(yīng)產(chǎn)生［16，17］。臍血里含有的細(xì)胞種類很多，包括T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、造血干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞等，這使它成為細(xì)胞治療領(lǐng)域非常有潛力的細(xì)胞來源［18-20］。已有的研究證實(shí)，使用臍血來源的CIK 治療腫瘤是安全可行的［21］。同時(shí)，臍血具有來源廣泛、同種異體反應(yīng)弱、病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)低的特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，26 例使用CB-CIK 治療的患者中，只有2 例出現(xiàn)畏寒和發(fā)熱的自限性不良反應(yīng)，與PB-CIK 的不良反應(yīng)無顯著差異，證明使用臍血來源的CIK 是安全的。

以往研究證實(shí)，CB-CIK 與PB-CIK 相比，其表面標(biāo)志及抗腫瘤效應(yīng)相似，增殖能力強(qiáng)，免疫原性低的特點(diǎn)［22-23］。本研究顯示，從相同量的臍血中分離出的PBMC 數(shù)與外周血無太大差異，而以相同的方法培養(yǎng)15 天后，臍血來源的CIK 的增殖倍數(shù)明顯高于外周血來源的，同時(shí)，CD3+CD56+細(xì)胞的倍數(shù)也顯著高于外周血來源的CIK，證明CB-CIK 的增殖潛能高于PB-CIK。

使用CIK 治療結(jié)直腸癌的臨床研究有很多，多與其他治療聯(lián)用，如與DC 聯(lián)用或與化療聯(lián)用。Dao 等［24］使用DC、CIK 聯(lián)合化療治療胃癌及結(jié)直腸癌患者并與單獨(dú)化療治療比較，結(jié)果顯示與單獨(dú)化療相比，聯(lián)合治療組的DFS 與5 年生存期顯著高于單獨(dú)化療組。另一項(xiàng)回顧性研究納入了96 例手術(shù)后的結(jié)直腸癌患者，21例使用CIK 聯(lián)合化療治療，其余75 例單獨(dú)使用化療治療，聯(lián)合治療組的DFS 比單獨(dú)治療組顯著提升［25］。2017 年一項(xiàng)Meta 分析納入了29 項(xiàng)臨床研究共2610例結(jié)直腸癌患者，結(jié)果顯示，與單獨(dú)化療的患者相比聯(lián)合CIK 或DC-CIK 治療的患者的DFS 及OS 有顯著提高［26］。本研究比較了臍血來源CIK 與外周血來源CIK的臨床療效，結(jié)果顯示兩組近期臨床療效無顯著差異，且無1 例CR 或PR。可能是因?yàn)楸狙芯考{入的都為晚期患者，病情較重，導(dǎo)致CIK 治療近期臨床療效不顯著，后期應(yīng)將聯(lián)合化療進(jìn)行比較。外周血腫瘤標(biāo)志物是一種常用的腫瘤治療評(píng)價(jià)指標(biāo)。CEA 在多種腫瘤中表達(dá)，包括結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌等。本研究顯示，52 例接受CIK 治療的結(jié)直腸癌患者CEA 水平有顯著降低，證明CIK 治療能使患者臨床獲益。但比較CB-CIK 組與PB-CIK 組治療后的CEA 值并無顯著差異，說明CBCIK 與PB-CIK 治療結(jié)直腸癌患者的近期臨床療效相似?；颊呙庖邔W(xué)指標(biāo)的變化也對(duì)免疫治療的療效有一定的意義。本研究結(jié)果顯示，兩組患者淋巴細(xì)胞亞群無顯著差異，但 CB-CIK 組治療后細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ）分泌水平顯著高于PB-CIK 組，證明CB-CIK 治療能更好地刺激患者免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤。

綜上所述，臍血來源的CIK 與外周血來源CIK 治療晚期結(jié)直腸癌患者是安全的，能使患者臨床獲益，但兩者近期療效無差異；同時(shí)臍血來源的CIK 比外周血來源CIK 更能改善患者免疫功能。這一區(qū)別可能會(huì)體現(xiàn)在長(zhǎng)期的生存期上，后期將繼續(xù)隨訪研究，對(duì)兩組患者的DFS 及OS 進(jìn)行比較。