劉思婷，單鳴秋，郭書臣

天麻為我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有治療頭暈、頭痛、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、降血壓等藥理作用。天麻中含量較高的成分是天麻素，現(xiàn)代藥理研究證明藥理作用與天麻相似，被認為是天麻的主要活性成分。但是仍有較多文獻指出天麻中所含香莢蘭醇及巴利森苷類成分也具有較強的生理活性，尤其是巴利森苷類在天麻中含量超過了天麻素與對羥基苯甲醇的含量。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定搜集于不同產地、不同藥店的市售天麻飲片中天麻素、對羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C6種活性成分的含量。

有較多研究表明，天麻還具有顯著的抗氧化活性作用。近年來，人們對抗氧化食品和藥物日漸熱衷，天麻作為一味天然純植物藥物，抗氧化性顯著，毒副作用較少，在抗氧化方面具有極佳的研究和開發(fā)價值。體外評價抗氧化活性的方法包括化學方法和生物學方法，主要表現(xiàn)在清除自由基、抑制脂質的氧化降解、抑制促氧化劑和還原能力幾個方面。其中清除1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH）自由基方法快速、簡便，是目前應用最廣泛的一種植物提取物體外抗氧化活性評價方法。本研究自2019年1—6月以HPLC-DPPH法評價天麻的抗氧化活性。結合天麻6種活性成分含量與抗氧化活性測定結果，探討天麻活性成分與天麻抗氧化活性之間的相關性，以期為天麻抗氧化方面的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

Shimadzu Librorael-40SM型電子分析天平，精確至0.01 mg；WATERSALLIANCE-2695 HPLC系統(tǒng)（配PDA檢測器，美國WATERS公司）；KQ-500B超聲清洗儀；Anke TGL-16B高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。天麻素、香莢蘭醇對照品，均購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號分別為00256-2013、01083-2013，對羥基苯甲醇、巴利森苷C、巴利森苷B、巴利森苷A、對照品，均購自南京森貝伽生物有限公 司，批 號 分 別 為2014-0192、2014-0080、2014-0079、2014-0078，所有對照品純度均≥98%。DPPH（純度＞97.0%，梯希愛上?；晒I(yè)）；水為純凈水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。共收集29批不同產地天麻飲片，購自江蘇省內各大藥店，均經(jīng)鑒定為蘭科天麻屬植物天麻Gastrdia elata B1.的干燥塊莖切片。

2 實驗方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 天麻對照品的制備 取各對照品加甲醇-水（3∶97）混合溶液制成混合對照品溶液：含天麻素60.30μg/mL、對羥基苯甲醇92.30μg/mL、香莢蘭醇3.02μg/mL、巴利森苷A310.86μg/mL、巴利森苷B95.54μg/mL、巴利森苷C445.72μg/mL。色譜圖見圖1。

2.1.2 天麻供試品的制備 取本品粉末（過三號篩）2 g，精密稱定，放入錐形瓶中，加入稀乙醇50 mL，振搖2 h，精密稱定質量，加熱回流3 h后放置至冷卻，再次精密稱定質量，以稀乙醇補足缺失質量，振搖，濾過，取濾液10 mL，濃縮至近干，加甲醇-水（3∶97）溶液溶解殘渣，移至25 mL容量瓶中，并用甲醇-水（3∶97）溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖：A為對照品溶液；B為供試品溶液

2.1.3 DPPH溶液配置 精密稱取16.32 mg DPPH標準品，加入甲醇溶液，振搖至溶解，制成濃度為100μg/mL的DPPH溶液，錫箔紙密封放入冰箱-20℃儲存。色譜圖見圖2A。

2.1.4 DPPH清除率實驗供試品溶液配置 精密稱取天麻樣品粉末（過三號篩）各0.2 g置于錐形瓶中，精密加入40%甲醇水溶液4 mL，搖勻，塞住瓶口，超聲（功率120 W，頻率40 kHZ）45 min，取出，以40%甲醇水溶液補足缺失重量，放入高速離心機，4 000 r/min離心10 min，取上清液，再在10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL按照“2.1.3”項下配置的DPPH溶液0.5 mL避光反應60 min，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。色譜圖見圖2B。

2.2 色譜條件

2.2.1 活性成分含量測定 色譜條件Hypersil C色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相為0.5%醋酸水溶液-0.5%醋酸甲醇溶液；體積流量：0.8 mL/min；檢測波長270 nm；進樣量：20μL。

2.2.2 DPPH清除率實驗 色譜條件Hedera ODS-2色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：0.2%甲酸水溶液-0.2%甲酸甲醇溶液；體積流量：1 mL/min；檢測波長：520 nm；進樣量：10μL。

圖2 高效液相色譜圖：A為DPPH溶液；B為供試品溶液

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系 精密量取5 mL混合對照品溶液，移至10 mL容量瓶中，加水至刻度。加入甲醇-水（3：97）混合溶液，以倍比稀釋法制成系列對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下，每個質量濃度進三針，分別進樣20μL，測定峰面積。以質量濃度（x，μg/mL）與峰面積平均值（y）進行線性回歸。結果見表1，數(shù)據(jù)顯示6種活性成分線性關系均較好，均r≧0.999 3。

2.3.2 精密度試驗 取編號為S9的天麻樣品，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6針，進樣量20μL，記錄各峰面積并計算RSD。結果見表2，均RSD＜3%，表明精密度良好。

表1 天麻6種成分的回歸方程

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取編號為S9的天麻樣品，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、1、2、4、6、9、12、18 h各進樣一次，共計8次，每次20μL，記錄各峰面積，計算RSD。結果見表3，均RSD＜3%，表明供試品溶液中6種成分在18 h內穩(wěn)定。

2.3.4 DPPH清除率實驗反應時間考察 精密稱取樣品0.2 g，按照“2.1.4”項下制備供試品溶液，加入100μg/mL DPPH溶液0.5 mL，分別反應30～120 min（間隔均為10 min），結果見圖3。如圖所示，樣品DPPH自由基清除率為24.96%～48.32%，其中反應達到60 min時，天麻對DPPH清除率達到最大值，60 min以后逐漸下降并趨于平穩(wěn)。本實驗選擇60 min為樣品與DPPH的反應時間。

2.3.5 DPPH清除率實驗反應濃度考察 精密量取DPPH溶液，加甲醇分別制成濃度為400、350、300、250、200、150、100、50μg/mL的DPPH對照品溶液。

表2 天麻6種成分的精密度

表3 天麻6種成分的穩(wěn)定性

圖3 天麻30～120 min內DPPH自由基反應動力學

精密稱取樣品0.2 g，共7份，按照“2.1.4”項下制備供試品溶液，分別加入上述不同濃度的DPPH對照溶液0.5 mL，反應60 min，結果見圖4。圖示隨著DPPH溶液濃度增大，DPPH自由基清除率不斷下降，其中濃度為400μg/mL時清除率達到最小，小于10%，濃度為100μg/mL時清除率達到最大值，接近60%，因而本文選取DPPH濃度100μg/mL作為反應濃度。

圖4 不同濃度的DPPH自由基清除率

3 實驗結果

3.1 6種活性成分含量測定 取29批天麻樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，用外標法計算其中的天麻素、香莢蘭醛、香莢蘭醇、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷B、巴利森苷A、巴利森苷C的含量，其結果見表4。

3.2 DPPH清除率 取29批天麻樣品，按照“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項色譜條件按下進樣，每次進樣10μL，測各峰面積，并根據(jù)下列公式計算清除率。結果見表5。

清除率=｛（A-Ai ） /A｝×100%。其中，A 為DPPH溶液0.5 mL+40%甲醇溶液0.5 mL的峰面積；Ai為各樣品所制成的供試品溶液的峰面積。

4 討論

天麻飲片6種活性成分的含量結果顯示天麻飲片中巴利森苷類成分含量最高，按照其含量高低排序為巴利森苷A＞巴利森苷B＞巴利森苷C；天麻素含量次之；對羥基苯甲醇與香莢蘭醇的含量最低。同時，除少數(shù)幾批外，大部分飲片中天麻素含量越高，巴利森苷類成分的含量也越高。而從化學結構看，巴利森苷B、A、C均為檸檬酸與天麻素結合而成的酯類。由此說明，巴利森苷類成分可能與天麻素存某種相互轉化或相互依存的內在聯(lián)系。

表4 29批天麻飲片中6種成分的百分含量/%

表5 29批天麻樣品的DPPH自由基清除率

DPPH清除率實驗結果顯示，天麻飲片反應1h后的DPPH自由基清除率達到41.94%～93.91%，說明天麻具有很強的抗氧化活性。其中，樣品S1～S4清除率為41.94%～54.94%，樣品S5～S29清除率為64.35%～93.91%，最高清除率高于最低清除率的兩倍。說明不同產地不同批次天麻飲片的抗氧化活性存在差異。

結合29批樣品6種活性成分的含量測定的結果與天麻飲片DPPH自由基清除率結果分析：（1）天麻素過去一直被認為是天麻的主要活性成分，利用EXCEL對天麻素含量與DPPH自由基清除率結果進行線性擬合，結果?=6.396 9x+76.999，r=0.068＜0.1，說明天麻素含量與天麻抗氧化活性無明顯相關性；（2）利用EXCEL分別對對羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量與DPPH自由基清除率結果進行線性擬合，結果相關系數(shù)r分別為0.148、0.155、0.122、0.023、0.073。說明對羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量與天麻抗氧化活性極弱正相關或無明顯相關性。（3）有研究表明，植物中的抗氧化活性可能與其總酚含量有關，總酚含量越高，抗氧化活性越強。本研究中6種活性成分均為酚性成分，同時也是天麻中含量較高的酚性成分，并且巴利森苷類成分可能與天麻素存在某種相互轉化或相互依存的內在聯(lián)系。因此研究6種活性成分與天麻抗氧化活性的相關性存在意義。利用EXCEL對6種活性成分含量總和與天麻飲片DPPH自由基清除率進行線性擬合，結果?=1.213 6x+82.472，r=0.050＜0.1，說明6種活性成分的含量總和與天麻飲片DPPH自由基清除率也無明顯相關性。

綜上所述，天麻任意一種活性成分或6種活性成分的總量與DPPH自由基清除率均無明顯關聯(lián)性，可能存在其他有效清除自由基的成分?；蛘撸m然所測的6種活性成分均為天麻酚性成分，但中藥材中的各種成分往往具有協(xié)同作用，抗氧化活性可能是由于多種活性成分的協(xié)同作用，而并不僅僅是單個成分或幾個成分作用的簡單疊加。