葉惠榮,張玉娟,曹茵,王西躍,吳麗華,陳桂林,陳麗娟,袁惠玲
三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TN‐BC)病人雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)表達(dá)均為陰性,約占乳腺癌的17%。TN‐BC因缺少PR、ER、HER2的表達(dá),不能接受分泌治療和抗HER2治療的手段,目前臨床上主要依賴化療,但其乳腺癌細(xì)胞具有強(qiáng)轉(zhuǎn)移和侵襲能力,導(dǎo)致相對其它類型乳腺癌,TNBC整體預(yù)后仍差。由于缺乏明確的治療靶點,因此越來越多學(xué)者關(guān)注TNBC治療靶點的研究。長鏈非編碼RNA(Long Non-coding RNA,lncRNA)長度一般為200個核苷酸序列,不編碼蛋白質(zhì),在X染色體滅活、染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控、MicroRNA活性、表觀基因調(diào)節(jié)等生物過程均發(fā)揮重要作用。lncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX Transcript Antisense RNA,HO‐TAIR)能夠通過反式作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),HOTAIR在TNBC組織中表達(dá)水平升高,與TNBC的臨床病理分期相關(guān)。但HOTAIR對TNBC細(xì)胞調(diào)控機(jī)制尚不清楚,本研究自2019年2—7月以TNBC細(xì)胞MDA-MB-231為模型,探究下調(diào)HO‐TAIR表達(dá)水平對MDA-MB-231細(xì)胞增殖、周期及侵襲能力的影響。
1.1 試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號:C11875500BT)、胎牛血清(FBS)(貨號:10091-148)均購自美國GIBCO公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(貨號11668019)購自武漢科昊佳生物科技有限公司;陰性對照si-Control、si-HOTAIR由上海吉瑪公司合成;兔抗人c-myc(貨號BS94081)、兔抗人Ki-67(貨號BS90768)、兔抗人PCNA(貨號BS6438)、兔抗人MMP-9(貨號BS6893)、兔抗人MMP-2(貨號BS72289)、兔抗人內(nèi)參β-Actin(貨號:AP0060)均購自美國Bioworld公司;羊抗兔二抗(貨號31466)購自美國Pierce公司;RNA提取試劑Trizol(貨號15596026)購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司;PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄-PCR試劑盒(貨號DRR042A)購自南京賽鴻瑞生物科技有限公司;FC 500系列流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾科技公司。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞系:正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A、TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231購自南京安研生物科技有限公司。MCF-10A細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞在相對濕度98%、5%二氧化碳、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)液為含有1%青鏈霉素雙抗、10%FBS的1640培養(yǎng)基,待細(xì)胞單層平鋪培養(yǎng)瓶約80%時胰酶消化傳代,收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染:實驗分為對照組、si-陰性對照組、si-HOTAIR組。嚴(yán)格按照說明書操 作 將si-HOTAIR(5'-GAACGGGAGUACAGAGA‐GAUU-3')和陰性對照si-Control(5'-TTCTCCGAAC‐GTGTCACGT-3')轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中,細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)48 h后用做后續(xù)實驗。
1.3 RT-qPCR檢測MDA-MB-231細(xì)胞HOTAIR表達(dá)水平 使用RNA提取試劑Trizol提取各組細(xì)胞總RNA,PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,嚴(yán)格按照PCR試劑盒說明書操作,將cDNA稀釋至25 ng/mL,然后加入到反應(yīng)體系中,使用PCR儀對HOTAIR進(jìn)行擴(kuò)增。HOTAIR正向引物序列:5’-GGGTGTTGGTCTGTGGAACT-3’,反向引物序列:5’-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3’;內(nèi)參GAP‐DH正 向 引 物 序 列:5’-CTTTGGTATCGTG‐GAAGGACTC-3’,反 向 引 物 序 列:5’-CAGT‐GGGGAACTCTGACTCG-3’,反應(yīng)條件:首先在94℃條件下預(yù)變性300 s,隨后94℃條件下變性30 s,65℃退火1 min,最后在60℃條件下延伸30 s,進(jìn)行30個循環(huán),60℃終末延伸5 min。各組設(shè)置6個復(fù)孔,采用2法對MDA-MB-231細(xì)胞HOTAIR表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。
1.4 MTT法測定MDA-MB-231細(xì)胞活性 將細(xì)胞以1×10個/孔接種到96孔板上,實驗分組同“1.2”,每組設(shè)置6個復(fù)孔,培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液,PBS清洗3次,加入不含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后加入25μL MTT(5 mg/mL)溶液,孵育4 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入150μL DMSO溶液,100 r/min 37℃恒溫震蕩10 min,使用多功能酶標(biāo)儀測定樣品在570nm處吸光度(OD值)。根據(jù)公式計算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD-空白組OD)×100%。
1.5 流式細(xì)胞儀測定MDA-MB-231細(xì)胞周期 收集MDA-MB-231細(xì)胞,實驗分組同“1.2”,設(shè)置6個復(fù)孔,離心后用預(yù)冷的PBS清洗3次,之后將細(xì)胞置于4℃70%乙醇中固定0.5 h,用預(yù)冷的PBS清洗3次,最后將細(xì)胞重懸于含有100μg RNaseA和40μg PI的PBS中,25℃避光孵育0.5 h,用流式細(xì)胞儀測定。
1.6 Transwell小室侵襲實驗測定MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel膠從-20℃冰箱中取出,4℃環(huán)境中過夜解凍,用1640培養(yǎng)液稀釋至200μL/mL,之后涂抹到transwell板的濾膜上面(200μL/cm),37℃放置3 h,取出后在超凈臺上干燥過夜。按照“1.2”實驗分組處理,設(shè)置6個復(fù)孔,將細(xì)胞以1×10個/孔接種到上室,同時下室加入600μL不含細(xì)胞的培養(yǎng)液,常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后更換上室培養(yǎng)液,然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,用棉簽輕輕擦去Matri‐gel和上室內(nèi)細(xì)胞,甲醇固定5 min,然后用PBS清洗3次,0.1%結(jié)晶紫染色5 min,PBS清洗3次后顯微鏡下拍照,每組隨機(jī)選擇6個視野計數(shù),取平均值。
1.7 蛋 白 印 跡 法(western blotting,WB)測 定MDA-MB-231細(xì)胞c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平 使用RIPA法提取各組細(xì)胞蛋白并測定總蛋白含量,垂直電泳法分離所需目標(biāo)蛋白,用BIO-RAD法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%BSA將結(jié)合位點封閉1 h。加入兔抗人c-myc、兔抗人Ki-67、兔抗人PCNA、兔抗人MMP-9、兔抗人MMP-2、兔抗人內(nèi)參β-Actin(稀釋比例均為1∶1 000),4℃孵育過夜,加入羊抗兔二抗(1∶1 000),PBS清洗3次,37℃孵育0.5 h,PBS清洗3次,顯色、曝光、凝膠成像設(shè)備觀察。
1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS22.0版軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示,多組比較行單因素方差分析,兩組均數(shù)相比行snk-q檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組MDA-MB-231細(xì)胞HOTAIR表達(dá)水平比較 與MCF-10A細(xì)胞組(1.06±0.13)相比,對照組MDA-MB-231細(xì)胞HOTAIR基礎(chǔ)表達(dá)水平(1.85±0.21)升高(P<0.05)。與對照組相比,si-HOTAIR組HOTAIR表達(dá)水平(1.34±0.15)降低(P<0.05),si-陰性對照組(1.80±0.31),差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.2 各組MDA-MB-231細(xì)胞活性比較 與對照組(102.64±3.29)%相比,si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞活性(98.04±6.28)%降低(P<0.05),si-陰性對照組(81.93±5.87)%無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.3 各組MDA-MB-231細(xì)胞周期比較 與對照組相比,si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞G0/G1期下調(diào),主要阻滯在G2/M期,si-陰性對照組無明顯變化,見圖1。
圖1 MDA-MB-231細(xì)胞周期:A為對照組;B為si-陰性對照組;C為si-HOTAIR組
2.4 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力比較 與對照組相比,si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞通過Matrigel到達(dá)濾膜底層的細(xì)胞數(shù)A明顯減少[(35.66±8.04)個比(125.92±13.55)個,P<0.05],si-陰性對照組[(128.17±16.53)個],差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.5 各組MDA-MB-231細(xì)胞中c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平比較 與對照組、si-陰性對照組相比,si-HOTAIR組c-myc、Ki-67、PC‐NA、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平降低(P<0.05),si-陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖2和表1。
圖2 MDA-MB-231細(xì)胞中c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平
TNBC相比其它類型乳腺癌,治療及預(yù)后、基因表型和生物學(xué)行為有明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)TNBC病人3~5年期間生存率較低,10年后復(fù)發(fā)率與其它乳腺癌病人相當(dāng)。因此,盡管TNBC侵襲性能力強(qiáng),預(yù)后差,但如能找到合適的治療靶點,TNBC仍有望臨床治愈。
近幾年,HOTAIR在乳腺癌組織中異常表達(dá)受到越來越多研究者的關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn),HOTAIR在TNBC病人外周血清和癌組織中表達(dá)水平升高,且在轉(zhuǎn)移性TNBC病人中尤其高。乳腺癌組織中HOTAIR高表達(dá),上調(diào)MCF-7細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)水平后,細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng),提示HOTAIR高表達(dá)有助于提高乳腺癌細(xì)胞侵襲能力。李苗等構(gòu)建MDA-MB-231細(xì)胞三維培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)RNA-HO‐TAIR表達(dá)水平升高。本研究證實,與MCF-10A細(xì)胞組相比,MDA-MB-231細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)水平升高,說明在MDA-MB-231細(xì)胞中HOTAIR高表達(dá),提示HOTAIR可能與TNBC有關(guān)。Liu等研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在肺癌組織和細(xì)胞系中的高表達(dá),敲除CAV-1后能夠下調(diào)HOTAIR表達(dá)水平,抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲,提示HOTAIR有望成為治療肺癌的新靶點。朱意等研究表明lncRNA-HOTAIR在前列腺癌癌組織中高表達(dá),與前列腺癌細(xì)胞的生長及侵襲能力有關(guān),使細(xì)胞G2期阻滯,G1期的下調(diào)。另有研究發(fā)現(xiàn),HOTAIR-siRNA組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖水平、侵襲能力與遷移能力低于對照組和陰性對照組,提示lncRNA-HOTAIR參與子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移侵襲進(jìn)程。本研究表明,與對照組、si-陰性對照組相比,si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞活性、侵襲能力降低,細(xì)胞G0/G1期下調(diào),主要阻滯在G2/M期,說明下調(diào)HOTAIR表達(dá)水平可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、降低侵襲能力,提示HO‐TAIR可能成為治療TNBC的新靶點。
表1 MDA-MB-231細(xì)胞中c-myc、Ki-67、PCNA、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達(dá)水平/x±s
c-myc作為位于細(xì)胞核的原癌基因,具有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等作用,研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)抑制cmyc蛋白表達(dá),可抑制TNBC細(xì)胞增殖。Ki-67蛋白具有200多個磷酸化部位,易受到相關(guān)蛋白酶作用,Ki-67蛋白是癌細(xì)胞增殖過程中必需的結(jié)合蛋白,是臨床上常用評價細(xì)胞增殖標(biāo)志物。PCNA在細(xì)胞核特異性表達(dá),與細(xì)胞增殖活性相關(guān),研究發(fā)現(xiàn),抑制PCNA蛋白表達(dá)水平,能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖。本研究表明,與對照組、si-陰性對照組相比,si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞中c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)水平降低,說明下調(diào)HOTAIR表達(dá)水平可能抑制c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表達(dá),提示下調(diào)HOTAIR可能通過降低c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)水平而抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖?;|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移,研究發(fā)現(xiàn),miR-125a-5p能夠通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路,下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)水平,從而抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移。楊彧、付雯研究發(fā)現(xiàn)TAGLN基因過表達(dá)可能通過下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)水平,從而抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。本研究表明,與對照組、si-陰性對照組相比,si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平降低,說明MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平可能受HOTAIR調(diào)控,提示下調(diào)HO‐TAIR水平使MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力下降可能通過抑制MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)實現(xiàn)。
綜上所述,HOTAIR在MDA-MB-231細(xì)胞中高表達(dá),下調(diào)HOTAIR表達(dá)水平可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、降低細(xì)胞侵襲能力。但是具體通過調(diào)控哪種信號通路影響MDA-MB-231細(xì)胞還有待進(jìn)一步研究。