何亞麗，劉宏

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種發(fā)病快、進(jìn)展迅速、病死率較高的內(nèi)科疾病，其可進(jìn)一步發(fā)展為全身炎癥反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致多個(gè)器官和系統(tǒng)功能障礙。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是SAP的常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是SAP病人死亡的主要原因。目前，臨床ARDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)基于柏林定義，但AR‐DS柏林診斷標(biāo)準(zhǔn)的臨床操作較為復(fù)雜，因此，急需簡(jiǎn)便、快捷診斷SAP合并ARDS的生物學(xué)指標(biāo)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc RNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是兩類(lèi)小分子非編碼RNA，參與調(diào)控免疫和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程，在炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（growth arrest specific tran‐script 5，GAS5）是一種lnc RNA，研究顯示，其在動(dòng)脈粥樣硬化病人斑塊和冠狀動(dòng)脈鈣化病人外周血中均表達(dá)升高，其高表達(dá)與IL-6等炎癥因子相關(guān)，是潛在的診斷和預(yù)測(cè)血管疾病的生物學(xué)指標(biāo)。miR-142-3p是一種miRNA，參與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牙周炎等炎癥性疾病的發(fā)展。目前，GAS5和miR-142-3p在SAP合并ARDS病人中的表達(dá)變化還未知。本研究主要探討了GAS5和miR-142-3p在SAP合并ARDS病人血清中的表達(dá)水平，并分析了其表達(dá)對(duì)該疾病的診斷價(jià)值和預(yù)后關(guān)系，以期為SAP合并ARDS疾病的診斷和預(yù)后判斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2017年2月至2018年12月平頂山市第一人民醫(yī)院就診的重癥急性胰腺炎（SAP）病人中，以隨機(jī)數(shù)字表法，按是否并發(fā)ARDS各抽樣約40例為研究對(duì)象，實(shí)抽樣共83例，均符合2015中國(guó)急性胰腺炎多學(xué)科診治共識(shí)意見(jiàn)中SAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)。ARDS則符合2011年柏林標(biāo)準(zhǔn)。所有被抽樣病人既往均無(wú)肺部慢性疾病及心功能不全，排除妊娠病人。其中并發(fā)ARDS病人構(gòu)成ARDS組，41例，男27例，女14例，年齡（54.26±7.31）歲；未并發(fā)ARDS病人構(gòu)成非ARDS組，42例，男22例，女20例，年齡（56.81±7.49）歲。另選取同時(shí)期40例健康體檢者資料作為健康對(duì)照組，其中男20例，女20例，年齡（55.84±7.93）歲。三組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。病人或其近親屬自愿簽署知情同意書(shū)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)血清中GAS5和miR-142-3p表達(dá)水平 采集ARDS組、非ARDS組病人確診后及健康對(duì)照組清晨空腹靜脈血于抗凝管中，3 500 r/min離心10 min，取上清-80℃保存?zhèn)溆?。Trizol試劑提取總RNA，微量核酸儀檢測(cè)RNA濃度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。GAS5以GAPDH為內(nèi)參，miR-142-3p以U6為內(nèi)參，采用2法計(jì)算GAS5和miR-142-3p的相對(duì)表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)：GAS5正向5'-GCAAGCCTA ACTCAAGCCATT-3'，反 向5'-CTC CACCATTTCAACTTCCAG-3'；miR-142-3p正 向5'-TGT AGTGTTTCCTACTTTATGGA-3'，反 向 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；GAPDH正 向5'-GTCCGTGACGTCGAAGTCGT-3'，反 向 5'-CG‐CAAAGTCGTGCGTGCAGATC-3'；U6正 向5'-CTC‐GCTTCGGCAGCACA-3'，反 向5'-AACGCTTCAC‐GAATTTGCGT-3'。

2 結(jié)果

2.1 GAS5和miR-142-3p在SAP合并ARDS病人血清中表達(dá)水平 與健康對(duì)照組比較，非ARDS組和ARDS組病人血清GAS5表達(dá)升高（P＜0.05），miR-142-3p表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與非ARDS組比較，ARDS組病人血清GAS5表達(dá)升高（P＜0.05），miR-142-3p表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 SAP合并ARDS病人血清中GAS5與miR-142-3p相關(guān)性 LncBase Experimental v.2生物信息學(xué)軟件顯示，GAS5與miR-142-3p的核苷酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，SAP合并ARDS病人血清GAS5與miR-142-3p呈負(fù)相關(guān)（r=-0.697，P＜0.001）。結(jié)果如圖1所示。

表1 重癥急性胰腺炎三組血清生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）與微小RNA-142-3p（miR-142-3p）表達(dá)水平比較/±s

圖1 重癥急性胰腺炎合并急性呼吸窘迫綜合征病人血清中生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）與微小RNA-142-3p（miR-142-3p）相關(guān)性：A為GAS5與miR-142-3p的核苷酸序列存在的結(jié)合位點(diǎn)；B為GAS5與miR-142-3p相關(guān)性

2.3 血清GAS5和miR-142-3p對(duì)SAP合并ARDS的診斷價(jià)值 分別探討血清GAS5和miR-142-3p對(duì)SAP合并ARDS的診斷價(jià)值，并采用SPSS的聯(lián)合應(yīng)用理論模式（LogP模式），建立ROC分析模型。分析結(jié)果：GAS5與miR-142-3p聯(lián)合檢測(cè)診斷SAP合并ARDS的靈敏度、特異度及曲線下面積（area under the curve，AUC）均高于GAS5、miR-142-3p的單獨(dú)應(yīng)用（Z分別為2.938，2.713，P分別為0.003，0.007）。結(jié)果如圖2和表2所示。

2.4 SAP合并ARDS組病人的血清GAS5和miR-142-3p表達(dá)水平與預(yù)后關(guān)系 41例SAP合并ARDS組病人，經(jīng)治療后26例存活，15例死亡。與存活病人比較，死亡病人SAP合并ARDS病人血清GAS5表達(dá)水平升高（P＜0.05），miR-142-3p表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

圖2 生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）、微小RNA-142-3p（miR-142-3p）及二者聯(lián)合檢測(cè)診斷重癥急性胰腺炎合并急性呼吸窘迫綜合征的受試者工作特征曲線（ROC）

表2 生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）、微小RNA-142-3p（miR-142-3p）及二者聯(lián)合檢測(cè)診斷重癥急性胰腺炎合并急性呼吸窘迫綜合征的受試者工作特征曲線（ROC）分析

表3 重癥急性胰腺炎合并急性呼吸窘迫綜合征存活和死亡病人生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）、微小RNA-142-3p（miR-142-3p）表達(dá)水平/±s

2.5 logistic回歸分析 建立非條件logistic回歸模型：（1）以SAP病人組為樣本（83例）：以是否并合并ARDS為因變量，賦值1=合并，0=未。以前述各研究過(guò)程中P＜0.10的指標(biāo)/因素為自變量，即GAS5和miR-142-3p兩指標(biāo)?；貧w過(guò)程采用逐步后退法，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α=0.10，α=0.05。兩個(gè)指標(biāo)均為連續(xù)變量，直接輸入?；貧w結(jié)果：GAS5和miR-142-3p均被保留入回歸模型（P＜0.05）。提示GAS5和miR-142-3p是SAP合并ARDS的顯著影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 重癥急性胰腺炎合并急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）logistic回歸分析結(jié)果

（2）以SAP合并ARDS組病人為樣本（41例），以預(yù)后情況（是否死亡）為應(yīng)變量，賦值1=死亡，0=存活。以GAS5和miR-142-3p為自變量，仿上行l(wèi)ogis‐tic回歸。結(jié)果：GAS5和miR-142-3p也均被保留入回歸模型（P＜0.05）。提示GAS5和miR-142-3p是SAP合并ARDS病人預(yù)后的顯著影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

ARDS是SAP的嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅病人生命健康。目前，ARDS缺乏簡(jiǎn)便快捷的臨床診斷指標(biāo)，尋找診斷SAP合并ARDS的生物學(xué)指標(biāo)具有重要意義。Lnc RNA是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，其可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等方面調(diào)控基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等生物學(xué)行為，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，其也參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，與炎性疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。研究表明，lnc RNA和miRNA在血清中具有高度穩(wěn)定性，且血清作為生物檢測(cè)樣本具有取材方便、無(wú)創(chuàng)傷性、可連續(xù)體外檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因此，血清lnc RNA和miRNA可作為疾病診斷和預(yù)后判斷的生物學(xué)指標(biāo)。

GAS5可參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等多種炎癥性疾病發(fā)展進(jìn)程中起重要作用。李春玲等研究顯示，多發(fā)性骨髓瘤病人血清GAS5表達(dá)升高，與其診斷多發(fā)性骨髓瘤的AUC為0.782，可用于輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤。陳桐等研究顯示，GAS5在糖尿病病人血清中表達(dá)降低，其診斷糖尿病的靈敏度為62.86%，特異度為77.78%，AUC為0.730，可作為診斷糖尿病的生物標(biāo)志物。但目前，還未見(jiàn)GAS5表達(dá)與SAP合并ARDS疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本研究顯示，SAP合并ARDS病人血清中GAS5表達(dá)高于單純SAP病人和健康健康對(duì)照組，其診斷SAP合并ARDS的靈敏性、特異度及ACU分別為82.5%、82.5%和0.805，是該疾病的獨(dú)立影響因素，提示其對(duì)該疾病具有較好的診斷價(jià)值。本研究還顯示，SAP合并ARDS死亡的病人血清GAS5水平明顯高于未死亡病人，提示GAS5高表達(dá)的病人預(yù)后較差，可作為預(yù)后判斷的生物學(xué)指標(biāo)。

Lnc RNA與miRNA存在調(diào)控關(guān)系。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，GAS5與miR-142-3p的核苷酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)，提示miR-142-3p可能是GAS5靶基因。研究顯示，miR-142-3p在骨關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)降低，上調(diào)miR-142-3p表達(dá)可降低脂多糖處理的軟骨細(xì)胞凋亡及炎性因子IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）生成，是骨關(guān)節(jié)炎治療的潛在分子靶標(biāo)。上調(diào)miR-142-3p可降低博來(lái)霉素誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡及炎癥因子IL-1和TNF-α表達(dá)，為特發(fā)性肺纖維化治療提供了新的治療策略。但目前，miR-142-3p在SAP合并ARDS病人血清中的表達(dá)及其對(duì)該疾病診斷和預(yù)后的關(guān)系還未知。本研究顯示，SAP合并ARDS病人血清中miR-142-3p表達(dá)低于單純SAP病人和健康健康對(duì)照組，提示miR-142-3p可能參與SAP合并ARDS疾病的發(fā)生發(fā)展，分析原因可能為miR-142-3p表達(dá)水平降低可參與調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞凋亡及炎性因子的表達(dá)。提示GAS5可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-142-3p表達(dá)從而參與SAP合并ARDS發(fā)生過(guò)程。ROC曲線分析顯示，miR-142-3p診斷SAP合并AR‐DS的靈敏性、特異度及ACU分別為84.4%、77.5%和0.859，具有較高的診斷價(jià)值。本研究還顯示，SAP合并ARDS死亡的病人血清miR-142-3p水平明顯低于未死亡病人，提示miR-142-3p低表達(dá)的病人預(yù)后較差。本研究Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，SAP合并ARDS病人血清中GAS5與miR-142-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，二者聯(lián)合檢測(cè)診斷對(duì)SAP合并ARDS的靈敏性、特異度及ACU分別為95.6%、92.5%和0.925，均顯著高于GAS5或miR-142-3p單獨(dú)診斷，提示聯(lián)合檢測(cè)血清GAS5與miR-142-3p對(duì)SAP合并ARDS診斷具有更高價(jià)值。

綜上所述，SAP合并ARDS病人血清中GAS5呈高表達(dá)，而miR-142-3p呈低表達(dá)，且二者間呈負(fù)相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)GAS5與miR-142-3p對(duì)該疾病具有較高診斷價(jià)值。血清GAS5、miR-142-3p是SAP合并ARDS發(fā)生發(fā)展的影響因素，可能為該疾病的診斷和預(yù)后判斷提供了新的生物學(xué)指標(biāo)。