李紀(jì)華，景治安，毛長青，劉彥軍，孔春艷

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。中國男性膀胱癌發(fā)病率高于女性，并且逐年上升。泌尿系腫瘤是膀胱癌最常見的亞型，占膀胱癌的90%以上。根據(jù)臨床和病理類型，膀胱癌主要分為兩類：淺表非肌層浸潤性膀胱癌和進(jìn)行性肌肉浸潤性膀胱癌?；熓前螂装┑闹匾委煼椒ㄖ?。然而，腫瘤細(xì)胞通常以多種方式獲得耐藥性，使化療效果較差。此外，在腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性后，其他生物學(xué)行為可能會發(fā)生變化，這可能對腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展產(chǎn)生重要影響。成纖維細(xì)胞生長因子受體2（FGFR2）剪切突變體FGFR2Ⅲc在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)間充質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變（MET），并使病灶轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。本研究選取143例膀胱癌組織標(biāo)本，探討FGFR2Ⅲc與膀胱癌發(fā)展和膀胱癌253J細(xì)胞對多柔比星耐藥性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年1月鄭州市第一人民醫(yī)院保存的膀胱癌組織標(biāo)本143例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)病理學(xué)確診；（2）病人臨床資料完整，對標(biāo)本保存及用途知情同意；（3）組織標(biāo)本獲取前未行放化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他惡性腫瘤；（2）復(fù)治病人。同時選取正常膀胱組織70例作為對照（來自開放手術(shù)的良性前列腺增生病人），膀胱癌組和正常膀胱組病人一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。組織取出后置于福爾馬林固定液中。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

表1 膀胱癌組和正常膀胱組一般資料比較

1.2 膀胱癌253J細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞株建立

人膀胱癌253J細(xì)胞系由西安交通大學(xué)研究所提供，用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，建立多柔比星耐藥253J/DOX細(xì)胞系。在實(shí)驗(yàn)前，將253J/DOX細(xì)胞在不含多柔比星的正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周。253J細(xì)胞系先在低濃度多柔比星（2×10g/L）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，穩(wěn)定生長（3×10g/L）后逐漸增加藥物濃度，6個月后，在含有1×10g/L多柔比星的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測

用胰蛋白酶消化321J細(xì)胞和253J/DOX細(xì)胞后，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，并以5 000細(xì)胞/孔的濃度接種在96孔板中用于常規(guī)過夜培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)上清液，用含有不同濃度多柔比星的培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)置5個平行孔。48 h后，加入PBS 200μL，洗滌3次。每孔加入20μL MTT，在培養(yǎng)箱中孵育4 h；吸出PBS，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO）。酶標(biāo)儀波長設(shè)置為490 nm檢測吸光度。通過SPSS軟件計(jì)算半數(shù)最大抑制濃度（IC）。

1.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 在調(diào)節(jié)253J細(xì)胞和253J/DOX細(xì)胞的細(xì)胞濃度后，將細(xì)胞以5×10細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板中，用PBS洗滌細(xì)胞3次，并加入無血清DMEM培養(yǎng)基中24 h。然后用200μL槍頭垂直6孔板平面畫橫線，用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后加入無血清培養(yǎng)基。在劃痕后0、8、16 h記錄照片。通過測量多個觀察點(diǎn)的劃痕寬度來計(jì)算劃痕愈合率。

1.5 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測 將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物濃度調(diào)節(jié)至0.2 g/L，通過SYBRGreen I嵌合熒光法在樣品上樣1μL進(jìn)行實(shí)時PCR反應(yīng)。GAPDH正向引物為5'-AT‐GGGGAAGGTGAAGGTCGG-3'，反向引物為5'-GACGGTGCCATGGAATTTGC-3'；FGFR2Ⅲc正向引物是5'-CCGGTGTTAACACCACGGACAAA-3'，反向引物是5'-CA GAACTGTCAACCATGCAGAGT‐GAAA-3'。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組和正常膀胱組FGFR2Ⅲc mRNA表達(dá)比較 膀胱癌組FGFR2Ⅲc mRNA相對表達(dá)量（1.782±0.342）明顯高于正常膀胱組（1.082±0.200），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.839，P=0.000）。

2.2 FGFR2Ⅲc mRNA表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征關(guān)系 病理分級高級別、病理分期T2～T4期FG‐FR2Ⅲc mRNA相對表達(dá)量明顯高于低級別和Ta～T1期（P＜0.05），見表2。

2.3 不同病理分級、病理分期病人性別、年齡比較 不同病理分級、病理分期病人性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.4 253J和耐多柔比星253J細(xì)胞FGFR2Ⅲc mRNA相對表達(dá)量等比較 耐多柔比星253J細(xì)胞FGFR2Ⅲc mRNA相對表達(dá)量和最大半數(shù)抑制濃度明顯高于253J細(xì)胞（P＜0.05），見表4。

2.5 253J和耐多柔比星253J細(xì)胞遷移率比較 耐多柔比星253J細(xì)胞遷移率（23.02±3.12）%明顯低于253J細(xì)胞（64.48±2.01）%（t=32.291，P=0.000）。

2.6 253J和耐多柔比星253J細(xì)胞凋亡率比較 耐多柔比星253J細(xì)胞凋亡率（23.22±5.50）%明顯低于253J細(xì)胞（43.32±4.44）%（t=20.331，P=0.000）。

表2 膀胱癌組織143例成纖維細(xì)胞生長因子受體2的剪切突變體Ⅲc（FGFR2Ⅲc）mRNA表達(dá)與膀胱癌病理特征關(guān)系/±s

表3 不同病理分級、病理分期病人性別、年齡比較

表4 253J和耐多柔比星253J細(xì)胞成纖維細(xì)胞生長因子受體2的剪切突變體Ⅲc（FGFR2Ⅲc）mRNA相對表達(dá)量比較/±s

3 討論

化療在膀胱癌的治療中起著重要作用。然而，腫瘤細(xì)胞可能由于天然表達(dá)或長期受到化學(xué)治療藥物的作用獲得各種抗藥性基因，從而降低治療效果甚至引起化療失敗。由多藥抗性基因MDR1編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物P-gp是具有多種底物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且是腫瘤中臨床化學(xué)抗性的主要原因之一。P-gp在膀胱癌等腫瘤中的表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對許多傳統(tǒng)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，并與病人預(yù)后不良密切相關(guān)。已有研究通過增加濃度方法建立了人膀胱癌253J的253J/DOX耐藥細(xì)胞系，與親代細(xì)胞相比，253J/DOX細(xì)胞中P-gp呈現(xiàn)高表達(dá)并且對多柔比星具有顯著耐藥性，該結(jié)果表明多柔比星耐藥253J細(xì)胞的耐藥性表型與P-gp相關(guān)，耐藥細(xì)胞系的建立可以為研究膀胱癌的化療耐藥性和腫瘤發(fā)展過程提供可靠的細(xì)胞模型。

FGFR是酪氨酸激酶受體，其通過與其相應(yīng)的配體成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）結(jié)合而介導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)。FGFR在腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用，并且研究已經(jīng)證實(shí)靶基因異常是由點(diǎn)突變，擴(kuò)增和染色體易位引起的。在腫瘤進(jìn)展等過程中，上皮產(chǎn)生的細(xì)胞可逐漸喪失上皮細(xì)胞的特征而獲得間質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)表型，這種現(xiàn)象稱為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。腫瘤細(xì)胞的局部浸潤能力增強(qiáng)，但是向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力減弱。間質(zhì)腫瘤細(xì)胞在該過程中的主要作用是通過降解細(xì)胞外基質(zhì)來幫助上皮腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。然而，在高級膀胱癌組織中，腫瘤細(xì)胞通常通過EMT失去上皮表型。Chaffer等發(fā)現(xiàn)FGFR2裂解突變體FGFR2Ⅲc在高級膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)使腫瘤細(xì)胞通過MET恢復(fù)上皮表型，然后形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶。

本次研究結(jié)果顯示，膀胱癌組和正常膀胱組FGFR2Ⅲc mRNA的表達(dá)明顯高于正常膀胱組。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示膀胱癌細(xì)胞可通過上調(diào)FGFR2Ⅲc表達(dá)獲得腫瘤病灶向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。FGFR2Ⅲc mRNA的表達(dá)與膀胱癌的臨床病理特征相關(guān)，F(xiàn)GFR2Ⅲc mRNA在高級病理分級和病理分期T2～T4中的相對表達(dá)顯著高于低級和Ta-T1期。這表明FGFR2Ⅲc mRNA表達(dá)與腫瘤分期和分級密切相關(guān)，表明FGFR2Ⅲc參與膀胱癌的發(fā)病機(jī)制。FG‐FR2Ⅲc mRNA的相對表達(dá)和253J和耐多柔比星253J細(xì)胞的最大半抑制濃度顯著高于253J細(xì)胞。與253J和多柔比星耐藥的253J細(xì)胞的細(xì)胞遷移率相比，多柔比星耐藥的253J細(xì)胞的遷移率和凋亡率顯著低于253J細(xì)胞。分析原因是253J細(xì)胞對多柔比星產(chǎn)生耐藥性后，通過MET重新得到上皮細(xì)胞表型，使體外遷移能力下降。據(jù)推測，EMT和MET都是腫瘤細(xì)胞衍生的化療耐藥表型中常見的現(xiàn)象。在臨床化療期間，腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷這種表型變化，導(dǎo)致局部上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞共存，這促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在高級別膀胱腫瘤中，化療后耐藥細(xì)胞中FGFR2Ⅲc的高表達(dá)可能導(dǎo)致一些腫瘤細(xì)胞通過MET重新獲得上皮表型，進(jìn)而形成轉(zhuǎn)移灶。

綜上所述，F(xiàn)GFR2Ⅲc mRNA在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)，與病理分級和病理分期有關(guān)，同時與253J細(xì)胞耐多柔比星、遷移有一定關(guān)系。