魯艷妮，焦琳，周清文，喬文

結(jié)腸癌屬于我國(guó)常見消化道惡性腫瘤之一，研究顯示結(jié)腸癌發(fā)病率逐年上升，生活方式改變及社會(huì)環(huán)境等因素與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類具有高度保守性的內(nèi)源性非編碼RNA分子，研究表明miRNA在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-4478（microRNA-4478，miR-4478）在大腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，并可能作為診斷大腸癌的分子標(biāo)記物。但目前miR-4478對(duì)腸癌生物行為的影響及其機(jī)制尚未完全闡明。鼠雙微體-2（mouse double minute 2 homolog，MDM2）在結(jié)腸癌中高表達(dá)且與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示MDM2高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可用于評(píng)估結(jié)直腸癌預(yù)后。RPL22可通過MDM2-p53信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌增殖。通過靶基因預(yù)測(cè)顯示MDM2可能是miR-4478的靶基因。因此，本研究主要探討miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，分析其對(duì)MDM的2調(diào)控作用，為揭示結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制及其基因治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2016年12月長(zhǎng)安醫(yī)院消化內(nèi)科結(jié)腸癌病人37例為研究對(duì)象，所有病人均經(jīng)病理證實(shí)且均接受結(jié)腸癌根治術(shù)，其中男20例，女17例，年齡（59.63±10.02）歲，年齡范圍為50～68歲。TNM分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期10例，Ⅲ期12例；分化程度：低分化10例，中分化21例，高分化6例；左半結(jié)腸癌20例，右半結(jié)腸癌17例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病人術(shù)前均未接受放療或化療；臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；既往手術(shù)史病人。所有病人知情且簽署同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。術(shù)中切除結(jié)腸癌組織及癌旁組織（＞5 cm），迅速放入液氮中保存。

1.2 材料與試劑 結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清與胰蛋白酶購自上海浩然生物技術(shù)公司；Trizol試劑與Lipofectamine2000購自美國(guó)Invitrogen公司；miR-4478 mimics及其陰性對(duì)照miR-NC、miR-4478抑制劑（anti-miR-4478）及其陰性對(duì)照anti-miR-NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；pcDNA3.1及pcD‐NA3.1重組質(zhì)粒購自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因載體及細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒均購自美國(guó)Promega公司；MDM2、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、P21、鈣粘附蛋白E（E-cadherin）單抗均購自美國(guó)CST公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；Mgteigel基質(zhì)膠購自美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞接種于6孔板，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)到75%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞隨機(jī)分為miR-4478陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染（miR-NC組）、miR-4478 mimics轉(zhuǎn)染（miR-4478組），抑制劑陰性轉(zhuǎn)染（anti-miR-NC組）、抑制劑轉(zhuǎn)染（anti-miR-4478組），miR-4478 mimics與pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染（miR-4478+pcDNA3.1組）、miR-4478 mimics與pcDNA3.1-MDM2共轉(zhuǎn)染（miR-4478+pcDNA3.1-MDM2組），利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2 miR-4478表達(dá)檢測(cè) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)腸癌組織及癌旁組織和不同轉(zhuǎn)染組結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞中miR-4478表達(dá)：取凍存結(jié)腸癌組織及癌旁組織，液氮中研磨，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，同時(shí)取各組轉(zhuǎn)染后48 h結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞，加入裂解液裂解細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共循環(huán)40次，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2法計(jì)算miR-4478相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞，以每孔1×10/mL密度接種于96孔板，置于溫度37℃、體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48、72 h棄培養(yǎng)液，每孔加入20μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩混勻，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm處各孔吸光度（OD）值。

1.3.4 細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取5×10個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室的上室中，觀察進(jìn)入Transwell小室下室的細(xì)胞數(shù)量即細(xì)胞遷移能力；細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：取1×10個(gè)細(xì)胞放入包被于Matrigel基質(zhì)膠稀釋液的Transwell小室的上室中，觀察穿過Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)入Transwell小室的下室的細(xì)胞數(shù)量即細(xì)胞侵襲能力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入含有0.2%胎牛血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10/mL，取200μL細(xì)胞懸浮液接種于Transwell小室的上室中，取500μL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基接種于Transwell小室的下室，將Transwell小室放入溫度37℃、體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，20%乙醇固定20 min，0.2%結(jié)晶紫溶液染色10 min，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）分析 收集各組細(xì)胞，加入裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白，采用SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜PVDF膜，采用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，用MDM2、Cy‐clin D1、MMP-2、P21、E-cadherin抗體（稀釋比1∶1 000）進(jìn)行孵育，4℃孵育24 h，TBST洗滌，室溫條件下加入二抗（稀釋比1∶5 000）孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL顯色，曝光，應(yīng)用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 采用PCR法將MDM2的3’UTR插入pLUC熒光素酶報(bào)告基因載體，構(gòu)建含有MDM2與miR-4478結(jié)合位點(diǎn)的野生型載體WT-MDM2，構(gòu)建含有MDM2與miR-4478突變結(jié)合位點(diǎn)的突變型載體MUT-MDM2，同時(shí)將結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞接種于96孔板，將WT-MDM2與miRNC、miR-4478 mimics分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，MUT-MDM2與miR-NC、miR-4478 mimics分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-4478在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá) qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸癌組織及其癌旁組織中miR-4478的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相對(duì)于癌旁組織，結(jié)腸癌組織中miR-4478的表達(dá)水平顯著降低［（0.84±0.07）比（0.26±0.02），t=48.461，P＜0.05］。

2.2 過表達(dá)miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116增殖的影響 分析miR-4478過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞增殖的影響，與miR-NC組相比，miR-4478組結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05），Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而P21蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖1、表1。

2.3 過表達(dá)miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116遷移、侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-4478組結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P＜0.05），MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖2、表2。

圖1 過表達(dá)miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116增殖蛋白表達(dá)的影響

圖2 過表達(dá)miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

圖3 MDM2的3’UTR含有miR-4478的互補(bǔ)序列

2.4 miR-4478靶向、調(diào)控MDM 2 靶基因預(yù)測(cè)顯示MDM2的3’UTR含有miR-4478的互補(bǔ)序列，見圖3。雙熒光素酶報(bào)告基因顯示，相對(duì)于miR-NC、WTMDM2共轉(zhuǎn)染組，miR-4478 mimics、WT-MDM2共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而相對(duì)于miR-NC、MUT-MDM2共轉(zhuǎn)染組，miR-4478 mim‐ics、MUT-MDM2共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），見表3。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-4478對(duì)MDM2的調(diào)控作用，與miR-NC組相比，miR-4478組細(xì)胞中MDM2蛋白顯著降低［（0.76±0.07）比（0.25±0.02），P＜0.05］；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-4478組細(xì)胞中MDM2蛋白顯著升高［（0.75±0.07）比（1.19±0.12），P＜0.05］，見圖4。

表1 過表達(dá)miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116增殖的影響/（x±s，n=6）

表2 過表達(dá)miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116遷移、侵襲的影響/（x±s，n=6）

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/x±s

圖4 miR-4478靶向、調(diào)控MDM2的表達(dá)

2.5 過表達(dá)MDM 2能逆轉(zhuǎn)miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116增殖、遷移、侵襲的影響 對(duì)比miR-4478+pcDNA3.1組，miR-4478+pcDNA3.1-MDM2組結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05），Cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），而P21、E-cad‐herin蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見圖5；表4，5。

3 討論

圖5 過表達(dá)MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-4478對(duì)細(xì)胞SW1116增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

結(jié)腸癌具有極強(qiáng)浸潤(rùn)性且惡性程度高，目前關(guān)于結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因而進(jìn)一步研究結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制對(duì)藥物靶點(diǎn)治療具有重要現(xiàn)實(shí)意義。miRNA可通過與靶基因特異性結(jié)合而抑制其翻譯轉(zhuǎn)錄進(jìn)而調(diào)控靶基因表達(dá)，研究表明miRNA可通過調(diào)控靶蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。既往研究報(bào)道指出結(jié)腸癌組織中miRNA差異性表達(dá)，并可通過調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。因此，本研究積極探尋結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程相關(guān)的miRNA，為揭示結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制及分子靶向治療提供新方向。

本研究結(jié)果表明結(jié)腸癌組織中miR-4478的表達(dá)水平明顯降低，提示miR-4478表達(dá)降低可能促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生。研究報(bào)道指出miR-4478表達(dá)異常還與心肌梗死等疾病發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。為探究miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，本研究通過miR-4478過表達(dá)，分析其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果表明miR-4478過表達(dá)可降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-4478過表達(dá)可明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞中P21、E-cadherin表達(dá)，而抑制Cyclin D1、MMP-2表達(dá)，已有研究報(bào)道顯示P21可通過抑制Cyclin D1與CDK形成復(fù)合物進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖，E-cadherin表達(dá)升高可通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移及侵襲，而MMP-2表達(dá)水平升高可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。提示miR-4478過表達(dá)可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，其可能作為結(jié)腸癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)基因。

表4 過表達(dá)MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116增殖的影響/（x±s，n=6）

表5 過表達(dá)MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-4478對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116遷移、侵襲的影響/（x±s，n=6）

MDM2屬于癌基因且在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)其主要通過阻斷p53轉(zhuǎn)錄而降解p53蛋白進(jìn)而減弱p53的抑癌功能最終促進(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展。MDM2基因可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡進(jìn)而調(diào)控腫瘤發(fā)展進(jìn)程，既往研究顯示MDM2在肝癌、乳腺癌等組織中高表達(dá)并可作為預(yù)測(cè)病人不良預(yù)后的重要標(biāo)志物，近來研究顯示MDM2高表達(dá)與胃癌病人臨床病理特征及其不良預(yù)后密切相關(guān)。王拴虎等研究表明上調(diào)miR-509-5p表達(dá)可通過抑制靶基因MDM2表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-4478與MDM2的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示miR-4478可靶向調(diào)控MDM2表達(dá)活性，提示MDM2是miR-4478的靶基因。進(jìn)一步分析顯示過表達(dá)MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-4478過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。提示miR-4478過表達(dá)可通過下調(diào)靶基因MDM2表達(dá)進(jìn)而降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。

綜上所述，miR-4478在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)下降，miR-4478過表達(dá)能夠靶向MDM2而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供新理論，其可能成為治療結(jié)腸癌的潛在靶點(diǎn)。