陳達(dá)書(shū)，蔣倩穎

卵巢癌是最致命的女性婦科惡性腫瘤之一，具有死亡率高、預(yù)后差和發(fā)病隱匿的特點(diǎn)。目前對(duì)于卵巢癌的治療主要包括放化療和手術(shù)切除病灶。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，卵巢癌的治療效果有所提升，但總體生存率并不樂(lè)觀。卵巢癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制十分復(fù)雜，這可能是導(dǎo)致卵巢癌的生存率低，預(yù)后差的主要原因。因此，探究并完善卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，有利于提高患者生存率和臨床療效。

IncRNA（Long non-coding RNAs）是長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA的一種。IncRNA廣泛參與生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，目前主要在腫瘤學(xué)領(lǐng)域被廣泛研究，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。linc 00261屬于In‐cRNA成員之一，目前已有研究表明linc 00261在喉鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，但在結(jié)腸癌、卵巢癌、胃癌等惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)。在腫瘤學(xué)中，IncRNA常作為海綿體，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MicroRNA，從而調(diào)控腫瘤增殖、遷移、侵襲和凋亡等過(guò)程。我們通過(guò)RNA22預(yù)測(cè)到linc 00261與miR-182之間存在結(jié)合位點(diǎn)。微小RNA-182（miR-182）屬于microRNA家族成員之一，是一種致癌基因。目前已有多項(xiàng)研究表明miR-182在三陰性乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌以及上皮性卵巢癌中表達(dá)升高，其具有促進(jìn)腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的作用。但目前尚無(wú)文獻(xiàn)表明在卵巢癌中l(wèi)inc 00261是否會(huì)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-182，進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲也尚未明確。同時(shí)我們進(jìn)一步通過(guò)RNA22網(wǎng)站篩選發(fā)現(xiàn)miR-182與RND3存在結(jié)合位點(diǎn)，且在過(guò)往研究中有報(bào)道m(xù)iR-182和RND3具有調(diào)控關(guān)系。RND3是Rho家族GTP酶家族成員之一，有研究表明RND3的過(guò)表達(dá)有利于肝癌、乳腺癌患者的預(yù)后，且RND3抑制多種癌細(xì)胞的增殖遷移和侵襲。但RND3是否作為一個(gè)廣譜性的抑癌因子，抑制癌癥的發(fā)展系目前尚無(wú)文獻(xiàn)證實(shí)。

本研自2019年11月至2020年3月通過(guò)培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系，并進(jìn)行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染，旨在探究明linc 00261與miR-182之間是否通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合關(guān)系，影響卵巢癌細(xì)胞的凋亡，miR-182與RND3是否存在靶向調(diào)控關(guān)系以及RND3對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞處理及分組

人卵巢表面上皮細(xì)胞系IOSE80和4株卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、HO8910、A2780和OVCAR（購(gòu)于ATCC），用含10%胎牛血清（10100139C，Gibco，USA）、鏈霉素（100 mg/mL）和青霉素（100 U/mL）的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（11965092，Gibco，USA）將細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，融合率達(dá)到85%以上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞按每孔1×10個(gè)接種于6孔板，37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24 h后，在細(xì)胞融合度達(dá)到了75%左右，按照Lipo‐fectamine 2000（11668-019，Invitrogen，New York，California，USA）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪生物公司，質(zhì)粒使用濃度為50 ng/mL，各組在37℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)6～8 h后，換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分組1：mimic NC（轉(zhuǎn)染mimic對(duì)照序列）、miR-182 mimic（轉(zhuǎn)染miR-182 mimic序列）；分組2：pcDNA-NC組（轉(zhuǎn)染pcDNA空載體）、pcDNA-linc 00261組（轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)linc 00261載體）、NCinhibitor組（轉(zhuǎn)染inhibitor對(duì)照序列）、miR-182 inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-182 inhibitor序列）、pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組（轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)linc 00261載體+miR-182 mimic序列）、pcD‐NA-linc 00261+si-RND3組（轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)linc 00261載體+si-RND3序列）。

1.2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

為構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體，將含有miR-182結(jié)合位點(diǎn)的RND3-3’UTR片段和linc 00261 cDNA片段插入到pGL3質(zhì)粒中。通過(guò)點(diǎn)突變方法，構(gòu)建結(jié)合位點(diǎn)突變的RND3-3′UTR-MUT片段和linc 00261-MUT片段插入到pGL 3質(zhì)粒中，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證插入序列正確。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將pGL3-linc 00261、pGL3-linc 00261-MUT、pGL3-RND3-3’UTR、pGL3-RND3-3’UTR-MUT重組載體和Rellina內(nèi)參質(zhì)粒分別與NC mimic或miR-182 mimic或共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集并裂解細(xì)胞，使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒（K801-200，Biovision公司），熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)采用雙熒光酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)（Promega，Madison，WI，USA）。海腎熒光素酶作為內(nèi)參基因，根據(jù)螢火蟲(chóng)熒光素酶測(cè)定值RLU除以海腎熒光素酶測(cè)定值RLU所得到的比值來(lái)比較目的報(bào)告基因的激活程度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖

采用CCK8檢測(cè)試劑盒（AC11L053，上海李記生物科技有限公司）檢測(cè)細(xì)胞活力。96孔板中以5×10/well密度接種100μL細(xì)胞懸液，在接種后的第24、48、72 h，每孔加入10μL CCK8溶液，輕柔混勻，不能產(chǎn)生氣泡，在37℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱反應(yīng)4 h后，用酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）測(cè)定各孔在450 nm處的吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

遷移實(shí)驗(yàn)：消化細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞懸液接種1×10個(gè)/毫升細(xì)胞懸液于上室，上室為無(wú)血清培養(yǎng)基，含10%FBS培養(yǎng)基加入下室，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室PBS沖洗2次每次5 min，5%戊二醛4℃固定，加0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗2次每次5 min，擦凈，境下觀察。各組穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)多少作為評(píng)價(jià)其遷移能力的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

侵襲實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，Matrigel基質(zhì)膠（貨號(hào)356234，BD公司，USA）4℃處理過(guò)夜，按1∶3用無(wú)血清培養(yǎng)基將其稀釋，在Transwell小室的上室內(nèi)每孔加入50μL，培養(yǎng)孵箱中靜置30 min。收集細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，無(wú)血清培養(yǎng)基洗Matrigel 1次，接種1×10個(gè)/毫升細(xì)胞懸液于上室，含10%FBS培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h，將Transwell小室用PBS沖洗2次，每次5 min，5%戊二醛4℃固定后，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗2次，每次5 min，擦干凈，鏡下觀察并計(jì)數(shù)。各組穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)多少作為評(píng)價(jià)其侵襲能力的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

Annexin VFITC/PI雙標(biāo)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，將處理好的細(xì)胞置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS溶液洗滌2次后離心將細(xì)胞重懸于200μL結(jié)合緩沖液中，加入10μL Annexin V-FITC（ab14085，Abcam，Inc，MA，USA）和5μL PI輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300μL結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀以激發(fā)波長(zhǎng)488 nm檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 RIP實(shí)驗(yàn)

采用RIP試劑盒（millipore，USA）檢測(cè)linc 00261與AGO2蛋白結(jié)合情況。冷PBS洗卵巢癌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞。等體積的RIPA裂解液（P0013B，碧云天）重懸細(xì)胞，冰上靜置5 min，14 000 r/min，4℃離心10 min取上清。細(xì)胞提取液一部分取出作為input，一部分與抗體孵育進(jìn)行共沉淀，具體步驟為：每一個(gè)共沉淀反應(yīng)體系取50μL磁珠清洗后重懸于100μL RIP Wash Buffer中加入5 μg抗體AGO2（ab32381，1∶50，Abcam，UK），IgG（1∶100，ab109489，Abcam，UK）孵育。磁珠-抗體復(fù)合物經(jīng)清洗后與重懸于900μL RIP Wash Buffer，加入100μL細(xì)胞提取液4℃孵育過(guò)夜。樣品置于磁座上收集磁珠-蛋白復(fù)合物。樣品經(jīng)蛋白酶K消化后提取RNA，qRT-PCR檢測(cè)linc 00261表達(dá)水平。

1.7 RNA pull-down

卵巢癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)T生物素化的和MUT生物素化的miR-182（各50 nmol/L）。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌，渦旋。然后，用特定的細(xì)胞裂解液（Ambion，Austin，Texas，USA）孵育10 min。將裂解物與預(yù)涂了RNase-free和酵母tRNA（購(gòu)自Sigma，St.Louis，MO，USA）的M-280鏈霉親和素磁珠（購(gòu)自Sigma，St.Louis，MO，USA）一起孵育。4℃條件下孵育3 h，然后用冷裂解液洗滌兩次，用低鹽緩沖液和高鹽緩沖液分別洗3次和1次，結(jié)合的RNA通過(guò)Trizol純化，qRT-PCR檢測(cè)linc 00261表達(dá)水平。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot，WB）檢測(cè)

收集細(xì)胞，棄上清，用含有蛋白酶抑制劑的增強(qiáng)型RI‐PA裂解液（武漢博士徳公司）進(jìn)行裂解，然后用BCA蛋白定量試劑盒（武漢博士徳公司）進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。蛋白溶于2×SDS上用10%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBS沖洗2 min，將PVDF膜與稀釋的一抗RND3（1∶1 000，ab171799，abcam，Cambridge，UK），Bax（1∶2 000，ab32503，abcam，Cambridge，UK），Bcl-2（1∶1 000，ab32124，abcam，Cambridge，UK），GAPDH（1∶2 000，ab 9485，abcam，Cambridge，UK）4℃過(guò)夜，TBST洗滌3次每次5 min，1∶100稀釋的HRP標(biāo)記二抗羊抗鼠IgG抗體（ab205719；1∶2 000；Abcam，Cambridge，UK）孵 育1 h。室 溫 下 膜 與ECL液（ECL808-25，Biomiga，USA）反應(yīng)1 min。吸去液體，覆蓋保鮮膜，然放上X-ray film曝光5～10 min后進(jìn)行顯影和定影。用Image J分析軟件對(duì)Western blot圖像中各組條帶進(jìn)行灰度定量，GAPDH作為內(nèi)參。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)

使用Trizol試劑盒（15596026，Invitrogen，Car，Cal，USA）提取細(xì)胞總RNA，按照PrimeScript RT re‐agent Kit（RR047A，Takara，Japan）說(shuō)明書(shū)將總的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)合成的cDNA用Fast SYBR Green PCR試 劑 盒（Applied biosystems）與ABI PRISM 7300 RT-PCR系統(tǒng)（Applied biosystems）進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，每個(gè)孔均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中用U6作為miR-182的內(nèi)參，GAPDH作為其他基因的內(nèi)參，采用相對(duì)定量法（2法）計(jì)算linc 00261、miR-182盒RND3的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平：ΔΔCt=ΔCt－ΔCt，ΔCt=Ct－Ct，目的基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平=2。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA linc 00261呈低表達(dá)，而miR-182呈高表達(dá)

qRTPCR檢測(cè)人卵巢表面上皮細(xì)胞株IOSE80和4株卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、HO8910、OVCAR和A2780中l(wèi)inc 00261和miR-182的表達(dá)，結(jié)果顯示：與人卵巢表面上皮細(xì)胞株IOSE80（1.00±0.11）相比，4株卵巢癌細(xì)胞SKOV3（0.25±0.04）、HO8910（0.71±0.08）、A2780（0.53±0.07）和OVCAR（0.36±0.05）中l(wèi)inc 00261的表達(dá)顯著降低，而miR-182的表達(dá)在SKOV3（3.46±0.42）、HO8910（2.07±0.21）、A2780（2.79±0.31）和OVCAR（2.98±0.32）中均顯著增加（均P＜0.05），其中SKOV3中l(wèi)inc 00261的表達(dá)最低，選為后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的細(xì)胞。

2.2 在卵巢癌細(xì)胞中l(wèi)inc 00261競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-182

運(yùn)用RNA22預(yù)測(cè)了linc 00261和miR-182的結(jié)合位點(diǎn)（圖1），linc 00261序列與miR-182序列間存在特異結(jié)合區(qū)域。雙熒光素酶報(bào)告：與NCmimic組（1.00±0.12）比較，miR-182 mimic組中l(wèi)inc 00261野生型與miR-182特異結(jié)合區(qū)域的熒光素酶活性受到顯著抑制（0.34±0.04），P＜0.001，而linc 00261突變型的熒光素酶活性無(wú)明顯的變化，說(shuō)明linc 00261能特異性結(jié)合miR-182。

RNA-pull down實(shí)驗(yàn)示，與MUT-miR-182（1.00±0.13）和Bio-NC組（1.23±0.15）相比，WT-miR-182結(jié)合的linc 00261明顯增加（14.36±1.32），P＜0.001，表明miR-182和linc 00261可直接結(jié)合。RNA免疫共沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CNE-1細(xì)胞內(nèi)linc 00261是否與AGO2蛋白直接相互作用。結(jié)果顯示在SKOV3細(xì)胞內(nèi)，抗AGO2的抗體可以將linc 00261沉淀下來(lái)，表明linc 00261可以與AGO2形成復(fù)合物，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-182。

圖1 RNA22預(yù)測(cè)了linc 00261和miR-182的結(jié)合位點(diǎn)

2.3 miR-182靶向調(diào)控RND3

qRT-PCR和WB分別檢測(cè)人卵巢表面上皮細(xì)胞株IOSE80和4株卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、HO8910、OVCAR和A2780中RND3 mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：與人卵巢表面上皮細(xì)胞株IOSE80（1.00±0.11）相比，4株卵巢癌細(xì) 胞SKOV3（0.37±0.04）、HO8910（0.69±0.07）、A2780（0.78±0.09）和OVCAR（0.35±0.05）中RND3 mRNA表達(dá)量均明顯降低。與人卵巢表面上皮細(xì)胞株IOSE80（0.86±0.11）相比，4株卵巢癌細(xì)胞SKOV3（0.25±0.03）、HO8910（0.52±0.05）、A2780（0.47±0.05）和OVCAR（0.27±0.03）中RND3蛋白表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）。

運(yùn)用RNA22預(yù)測(cè)了miR-182和RND3的結(jié)合位點(diǎn)（圖2），雙熒光素酶報(bào)告顯示：與NC mimic組（1.00±0.13）比較，miR-182 mimic轉(zhuǎn)染組RND3野生型3'UTR的熒光素酶活性（0.28±0.03）明顯收到抑制（P＜0.05），而突變型3'UTR的熒光素酶活性變化無(wú)明顯差別（P＞0.05），以上結(jié)果說(shuō)明miR-182能靶向抑制RND3基因。

上述結(jié)果表明，在卵巢癌中l(wèi)inc 00261可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-182從而調(diào)控RND3基因的表達(dá)。

圖2 RNA22預(yù)測(cè)了linc 00261和miR-182的結(jié)合位點(diǎn)

2.4 過(guò)表達(dá)linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢癌細(xì)胞增殖

在卵巢癌細(xì)胞SKOV3中，我們通過(guò)過(guò)表達(dá)linc 00261或者沉默miR-182，以及在過(guò)表達(dá)linc 00261的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)miR-182或者沉默RND3基因，來(lái)研究linc 00261可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-182從而調(diào)控RND3，對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。

CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果表明：與pcDNA-NC組（0.46±0.05）、（0.87±0.09）相比，pcD‐NA-linc 00261組卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖能力在48 h和72 h時(shí)顯著下降（0.30±0.04）、（0.49±0.06）；與NC inhibitor（0.47±0.04）、（0.91±0.11）相比，miR-182 inhibitor卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖能力在48 h和72 h時(shí)顯著下降（0.27±0.03）、（0.27±0.03）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組（0.45±0.03）、（0.82±0.09）和pcDNAlinc 00261+si-RND3組（0.44±0.03）、（0.90±0.09）卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖能力在48 h和72 h時(shí)顯著增加（均P＜0.05）。以上結(jié)果表明過(guò)表達(dá)linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，而miR-182的過(guò)表達(dá)或RND3的沉默可以逆轉(zhuǎn)linc 00261過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用。?

2.5 過(guò)表達(dá)linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢癌細(xì)胞遷移能力

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力，結(jié)果表明（圖3）：與pcDNA-NC組（117.40±16.30）相比，pcDNA-linc 00261組卵巢癌細(xì)胞SKOV3的 遷 移 能 力（73.4±8.9）顯 著 下 降（P=0.017）；與NC inhibitor（124.30±14.50）相 比，miR-182 inhibitor卵巢癌細(xì)胞SKOV3的遷移能力（68.40±7.80）顯著下降（P=0.003）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組（118.30±13.90）和pcDNA-linc 00261+si-RND3組（125.4±16.9）卵巢癌細(xì)胞SKOV3的遷移能力顯著增加（均P＜0.05）。以上結(jié)果表明過(guò)表達(dá)linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢6 癌細(xì)胞7遷 移，而8miR-182的過(guò)表達(dá)或RND3的沉默可以逆轉(zhuǎn)linc 00261過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移能力的抑制。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SKOV3細(xì)胞遷移能力（×200）：A為pcDNA-NC組；B為pcDNA-linc 00261組；C為NCinhibitor組；D為miR-182 inhibitor組；E為pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組；F為pcDNA-linc 00261+si-RND3組

2.6 過(guò)表達(dá)linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲能力

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果表明（圖4）：與pcDNA-NC組（75.20±8.90）相比，pcDNA-linc 00261組卵巢癌細(xì)胞SKOV3的侵襲能力（42.30±4.50）明顯降低（P=0.003）；與NC inhibitor（79.20±9.30）相比，miR-182 inhibitor卵巢癌細(xì)胞SKOV3的侵襲能力（47.30±6.30）明顯降低（P=0.004）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNAlinc 00261+miR-182 mimic組（76.30±8.30）和pcD‐NA-linc 00261+si-RND3組（81.40±9.30）卵巢癌細(xì)胞SKOV3的侵襲能力顯著增加（均P＜0.05）。以上結(jié)果表明過(guò)表達(dá)linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲，而miR-182的過(guò)表達(dá)或RND3的沉默可以逆轉(zhuǎn)linc 00261過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的抑制。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SKOV3細(xì)胞侵襲能力（×200）：A為pcDNA-NC組；B為pcDNA-linc 00261組；C為NCinhibitor組；D為miR-182 inhibitor組；E為pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組；F為pcDNA-linc 00261+si-RND3組

2.7 過(guò)表達(dá)linc 00261或沉默miR-182促進(jìn)卵巢癌凋亡

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明（圖5）：與pcDNA-NC組（8.20±0.90）相比，pcDNA-linc 00261組卵巢癌細(xì)胞SKOV3的凋亡率（32.30±3.20）明顯上調(diào)（P＜0.05）；與NC inhibitor（9.40±1.20）相 比，miR-182 inhibitor卵 巢 癌 細(xì) 胞SKOV3的 凋 亡 率（30.50±2.70）明 顯 增 加（P＜0.001）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組（10.20±1.20）和pcDNAlinc 00261+si-RND3組（11.30±1.50）卵巢癌細(xì)胞SKOV3凋亡率顯著下降（P＜0.05）。以上結(jié)果表明過(guò)表達(dá)linc 00261或沉默miR-182促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，而miR-182的過(guò)表達(dá)或RND3的沉默可以逆轉(zhuǎn)linc 00261過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組SKOV3細(xì)胞凋亡圖：A為pcDNA-NC組；B為pcDNA-linc 00261組；C為NCinhibitor組；D為miR-182 inhibi‐tor組；E為pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組；F為pcDNA-linc 00261+si-RND3組

2.8 linc 00261競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-182調(diào)控RND3基因參與卵巢癌癌細(xì)胞的凋亡

qRT-PCR檢測(cè)linc 00261、miR-182和RND3 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：與pcDNA-NC組相比，pcDNA-linc 00261組卵巢癌細(xì)胞中l(wèi)inc 00261（3.24±0.35）和RND3 mRNA（2.36±0.28）表達(dá)顯著增加，miR-182（0.39±0.04）表達(dá)顯著減少（均P＜0.05）；與NCinhibitor相比，miR-182 in‐hibitor組卵巢癌細(xì)胞SKOV3中l(wèi)inc 00261表達(dá)（0.98±0.11）無(wú)顯著變化（P=0.969），miR-182表達(dá)（0.36±0.04）顯著減少，RND3 mRNA表達(dá)（2.56±0.32）顯著增加（均P＜0.05）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組卵巢癌細(xì)胞SKOV3中l(wèi)inc 00261表達(dá)（3.17±0.31）無(wú)顯著變化（P=0.997），miR-182表達(dá)（1.16±0.13）顯著增加，RND3 mRNA表達(dá)（0.92±0.11）顯著減少（均P＜0.05）；與pcDNA-linc 00261組 相 比，pcDNA-linc 00261+si-RND3組卵巢癌細(xì)胞linc 00261（3.29±0.33）和miR-182（0.42±0.05）變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.999），RND3 mRNA表達(dá)（0.89±0.09）顯著減少（P＜0.001）。

WB檢測(cè)RND3和凋亡相關(guān)因子Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：與pcDNA-NC組相比，pcDNA-linc 00261組卵巢癌細(xì)胞SKOV3中RND3（0.58±0.07）和Bax（0.52±0.06）蛋白表達(dá)顯著增多（P＜0.01），而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)量（0.15±0.02）明顯降低（P＜0.001）；與NC inhibitor相比，miR-182 inhibitor卵巢癌細(xì)胞SKOV3中RND3（0.61±0.07）和Bax蛋白表達(dá)（0.58±0.06）顯著增加，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)（0.18±0.03）顯著減少（均P＜0.05）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組和pcDNAlinc 00261+si-RND3組卵巢癌細(xì)胞RND3（0.30±0.04）、（0.32±0.04）和Bax蛋白表達(dá)（0.21±0.03）、（0.22±0.03）顯著減少，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)（0.52±0.05）、（0.54±0.06）顯著增多（均P＜0.05）。

以上結(jié)果表明linc 00261通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-182，從而調(diào)控RND3基因，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌癌細(xì)胞的凋亡。

3 討論

卵巢癌是婦科癌癥中死亡率的重要惡性腫瘤之一，患者主要群體為年齡大于65歲的女性。到目前為止，每年全球有超過(guò)20萬(wàn)女性被確診卵巢癌，但卵巢癌的生存率不到35%。且由于卵巢癌隱匿性強(qiáng)，在癌癥早期不易被診斷，從而導(dǎo)致患者預(yù)后生存差。探究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，為早期卵巢癌確診與后續(xù)治療均具有非常重要的指導(dǎo)意義。

IncRNA和microRNA均為非編碼RNA，由于其調(diào)控廣泛，且在生物中大量存在，因此是目前腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的重要研究熱點(diǎn)。linc 00261在大部分癌癥中表達(dá)下調(diào)。Shandy Shahabi等研究表明，linc 00261在肝癌、乳腺癌以及胃癌中發(fā)生缺失，可通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞中的DNA損傷機(jī)制，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞周期進(jìn)程。Jingli Shi等研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中，低表達(dá)linc 00261存在不良預(yù)后。linc 00261過(guò)表達(dá)后抑制非小細(xì)胞肺癌增殖和侵襲，促進(jìn)其凋亡。linc 00261可作為海綿體，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-522-3p，從而調(diào)控非小細(xì)胞肺癌增殖、侵襲以及凋亡。還有研究表明linc 00261在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)下調(diào)，且可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-182、miR-183、miR-153、miR-27a和miR-96等mi‐croRNA，進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。有研究表明，miR-182在肺鱗狀細(xì)胞癌中存在異常表達(dá)，可能作為肺鱗狀細(xì)胞癌的標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。此外，有研究認(rèn)為miR-182在結(jié)直腸癌、乳腺癌中均可作為標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。這提示miR-182可能在癌細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用。在本研究中，我們進(jìn)一步證實(shí)linc 00261在卵巢癌中表達(dá)下調(diào)，且經(jīng)過(guò)雙熒光素酶等實(shí)驗(yàn)證實(shí)linc 00261可作為海綿體，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-182，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

在腫瘤中，microRNA通常通過(guò)靶向調(diào)控下游靶基因，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)特性。在本研究中，我們通過(guò)RNA22篩選發(fā)現(xiàn)miR-182與RND3之間存在結(jié)合位點(diǎn)。RND3作為Rho家族GTP酶家族成員之一，在腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究較多，但尚無(wú)研究表明RND3對(duì)卵巢癌的影響。RND3參與細(xì)胞有絲分裂調(diào)控，對(duì)細(xì)胞增殖具有負(fù)向調(diào)控作用。在鼻咽癌中，RND3表達(dá)下調(diào)后，加速了鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲。為探究在卵巢癌中，miR-182是否會(huì)通過(guò)靶向調(diào)控RND3，進(jìn)而調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡。我們通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告證實(shí)miR-182可靶向調(diào)控RND3的表達(dá)，且RND3沉默后，可阻斷l(xiāng)inc 00261對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，以及對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

綜上所述，在本研究中我們通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中l(wèi)inc 00261可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-182，從而促進(jìn)其靶基因RND3的表達(dá)，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示miR-182可作為卵巢癌的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。通過(guò)本研究，我們證實(shí)了linc 00261、miR-182和RND3在卵巢癌中的表達(dá)，以及三者的調(diào)控關(guān)系。但本研究目前僅限于體外實(shí)驗(yàn)，我們?nèi)孕柽M(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證以上機(jī)制。并通過(guò)更多的實(shí)驗(yàn)探究，并確認(rèn)最終能否用于臨床檢驗(yàn)診斷與靶向治療。