劉思佳，田少楠，高蘭蘭，劉 耀，王拓一

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161000）

大白菜（Brassica ChinensisL.）屬十字花科植物，是我國北方地區(qū)消費量和貯藏量最大的蔬菜品種之一[1]。大白菜在貯藏期間會出現(xiàn)萎縮、黃化、脫幫等現(xiàn)象，導(dǎo)致貯藏品質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重變化[2]。脂質(zhì)是生物代謝過程中的重要物質(zhì)，近年來有研究表明，脂質(zhì)過氧化能夠引起植物脂肪降解，致使細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致植物衰老[3-4]。因此，研究大白菜貯藏期間脂肪含量變化以及相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律，對提高大白菜貯藏品質(zhì)具有重要的意義。

LIP2和LOX2是大白菜脂肪代謝過程中的兩個關(guān)鍵調(diào)控基因，在脂類氧化過程中起關(guān)鍵作用。LIP2是解脂耶氏酵母中最早發(fā)現(xiàn)的脂肪酶相關(guān)基因，該基因編碼的蛋白含有334 個氨基酸，可以分泌到胞外，是一種胞外酶[5]。LOXs大量存在于動物、植物和微生物中[6]，在植物中主要分布于脂質(zhì)體、微粒體等，同時在脂質(zhì)體膜和質(zhì)膜上也有發(fā)現(xiàn)[7-8]。LOX2是植物體內(nèi)一類重要的同工酶，也是植物體內(nèi)催化脂質(zhì)降解的關(guān)鍵酶[9]，在整個植物生長過程中發(fā)揮著重要作用[10]。由于LOX2的反應(yīng)產(chǎn)物可進(jìn)一步產(chǎn)生自由基，對細(xì)胞膜具有一定的破壞作用，因此被認(rèn)為是植物衰老的促進(jìn)劑[11]。

光作為重要的環(huán)境因子，在植物的生長發(fā)育以及物質(zhì)代謝中都起到了極其重要的作用。雷靜等[12]在4 ℃貯藏櫻桃番茄過程中采用LED 紅藍(lán)單色弱光照射櫻桃番茄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅藍(lán)單色弱光能夠延緩櫻桃番茄衰老，保持營養(yǎng)成分；Jin 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，LED 紅光更有利于保持西蘭花的品質(zhì)，而LED 藍(lán)光對西蘭花的老化沒有顯著影響；Ma 等[14]發(fā)現(xiàn)LED 綠光照射延長了西蘭花的貨架期；田少楠等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與白光貯藏條件相比，黑暗條件下LIP2和LOX2的表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，而脂肪含量呈下降趨勢。本文以大白菜為研究對象，分析了不同光源貯藏下LIP2和LOX2基因的表達(dá)規(guī)律以及脂肪含量變化，以期為大白菜貯藏技術(shù)的創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：大白菜品種為‘北京新三號’，購于黑龍江省齊齊哈爾市當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

試劑：38%Trizol，賽默飛世爾科技公司；三氯甲烷，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；99.7%無水乙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠；99.7%異丙醇，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；36%～38%鹽酸，遼寧泉瑞試劑有限公司；石油醚（30～60 ℃沸程），西安天茂化工有限公司；DEPC 處理水、DNA marker，上海生工生物工程有限公司；6×loading buffer，索萊寶公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII，TaKaRa公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit、5×Prime ScriptTMRT Master Mix，TaKaRa 公司；瓊脂糖，蘇州宇恒生物科技有限公司；Super Gel Red，博美生物科技有限公司；50×TAE緩沖溶液，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；RT-qPCR引物。

1.2 儀器與設(shè)備

JY 電泳儀，北京華威興業(yè)科技有限公司；Quant Studio3 實時熒光定量PCR 儀，上海巴玖實業(yè)有限公司；FA2204C 電子天平，浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；TD5Z冷凍離心機(jī)，鹽城市凱特實驗儀器有限公司；P70D20TJ-D3 微波爐，格蘭仕微波爐電器有限公司；UV-3000 紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司；HHS-11-2 數(shù)字恒溫水浴鍋，山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司；101-1-BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；自制光照保鮮柜。

1.3 試驗方法

1.3.1 大白菜預(yù)處理

將采購的新鮮大白菜去除表面泥垢后，用保鮮膜密封，分別存入紅、藍(lán)、綠三層光照貯藏保鮮柜中，每層存放3 顆，紅光強(qiáng)度范圍245～465 lux，綠光強(qiáng)度范圍1 972～3 457 lux，藍(lán)光強(qiáng)度范圍1 178～2 296 lux，保鮮柜溫度設(shè)置為4 ℃。

1.3.2 大白菜總RNA 的提取

分別稱取三種光照條件下貯藏的大白菜0.100 0 g，放入1.5 mL RNase-free EP 管中，分別在3 支EP 管中加入0.5 mL Trizol 試劑，冷金屬浴上進(jìn)行充分研磨。按照Trizol 法提取植物RNA 的方法提取大白菜RNA，將得到的RNA 室溫干燥5～10 min 后，加入20 μL DEPC 處理水溶解，再進(jìn)行電泳檢測，紫外分光光度計測量RNA 濃度，并保存于-80 ℃。

1.3.3 cDNA 的合成

按照5×Prime ScriptTMRT Master Mix 3.5 μL、RNA 2 μL、ddH2O 4.5 μL 配置成10 μL 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系；混合均勻后離心，再進(jìn)行cDNA 的合成。PCR 反應(yīng)條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃無限循環(huán)，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為40 個；反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 稀釋10 倍使用。

1.3.4 實時熒光定量PCR（Real-time qPCR）分析

Real-time qPCR 反應(yīng)體系包括5 μL TB-Green、0.5 μL P CR Forward Primer （10 μmol）、0.5 μL PCR Reverse Primer（10 μmol）、3 μL ddH2O、1 μL 樣品cDNA，構(gòu)成總體積為10 μL 的反應(yīng)體系。Real-time qPCR 反應(yīng)條件為95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，40 個PCR 循環(huán)，采用默認(rèn)設(shè)置自動生成Ct 值。每個樣品設(shè)置3 個重復(fù)，用相對定量2-ΔΔCt法計算分析基因的表達(dá)水平。

1.3.5 基因引物序列

基因序列來自brassicadb.org，并利用NCBI-BLAST進(jìn)行對比。基因引物序列獲取自https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/primers，并利用NCBI-Primer-BLAST 進(jìn)行驗證[16]，引物序列表見表1。

1.3.6 大白菜脂肪提取與測定

參考GB 5009.6—2016 食品脂肪的檢驗方法測定大白菜的脂肪含量[17]，選擇酸水解法進(jìn)行操作[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 單因素方差分析（One Way ANOVA）。所有數(shù)據(jù)均采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜中脂肪代謝基因在不同光源下的表達(dá)

2.1.1 大白菜中LIP2基因在不同光源下的表達(dá)

利用實時熒光定量PCR 方法，分析紅光、藍(lán)光、綠光貯藏條件下，大白菜LIP2基因的相對表達(dá)量，見圖1。經(jīng)過40 d 光照貯藏后，與貯藏初期相比，大白菜LIP2基因的表達(dá)量明顯下降。研究表明，解脂耶氏酵母LIP2是一種更高效的脂肪酶，比活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它脂肪酶[19]。方差分析表明，在貯藏初期，紅、藍(lán)、綠三種光源下LIP2基因的表達(dá)無顯著差異，而貯藏40 d 后，LIP2基因的表達(dá)量在綠光下顯著大于在紅光和藍(lán)光下的。LIP2基因的表達(dá)量高，脂肪酶的含量高，從而加快了脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致脂肪含量降低。

圖1 大白菜LIP2 基因在不同光源條件下的表達(dá)Fig.1 Expression of LIP2 gene in Chinese cabbage under different light sources

2.1.2 大白菜中LOX2基因在不同光源下的表達(dá)

有研究發(fā)現(xiàn)，TCX8通過與TCP20或TCP4結(jié)合LOX2啟動子來調(diào)控LOX2的表達(dá)，從而影響茉莉酸的生物合成，延緩脂質(zhì)的降解[20]。本試驗利用實時熒光定量PCR 方法，分析了紅光、藍(lán)光、綠光貯藏條件下，大白菜LOX2基因的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖2 所示。由圖可知，經(jīng)過40 d 貯藏，與貯藏初期相比，大白菜LOX2基因的表達(dá)量明顯下降。方差分析表明，貯藏初期，紅、藍(lán)、綠三種光照條件下LOX2基因的表達(dá)無顯著差異；而貯藏40 d后，LOX2基因的表達(dá)量在綠光條件下顯著大于在紅光和藍(lán)光條件下的。可見，LOX2基因的表達(dá)量低，能夠延緩脂肪代謝，有利于脂肪的保持。

表1 引物序列表Table 1 List of primers

圖2 大白菜LOX2 基因在不同光源條件下的表達(dá)Fig.2 Expression of LOX2 gene in Chinese cabbage under different light sources

2.2 大白菜貯藏過程中在不同光源下脂肪含量變化

由圖3 可知，經(jīng)過40 d 貯藏后，與貯藏初期相比，大白菜的脂肪含量明顯下降。根據(jù)方差分析，貯藏初期，紅、藍(lán)、綠三種光照條件下大白菜的脂肪含量無顯著差異。而貯藏40 d 后，脂肪含量在綠光條件下顯著小于在紅光和藍(lán)光條件下的。LIP2和LOX2是大白菜脂肪代謝過程中的兩個關(guān)鍵調(diào)控基因，LIP2和LOX2表達(dá)量越高，脂肪含量越低。經(jīng)過40 d 貯藏后，LIP2和LOX2基因的表達(dá)量在綠光條件下顯著大于在紅光和藍(lán)光下的（圖1、2），而綠光貯藏條件下，脂肪含量降低的幅度更大，可見紅光、藍(lán)光更有利于大白菜貯藏過程中脂肪的保持。

圖3 大白菜在不同光源條件下的脂肪含量Fig.3 Fat content in Chinese cabbage under different light sources

3 結(jié)論與討論

有研究發(fā)現(xiàn)，LIP2 蛋白和胰脂肪酶一樣，可以使三?；视凸羌艿耐獠课恢胹n-1 和sn-3 處的酯鍵水解，LIP2 蛋白還可以從三酰基甘油分子中生成一個2-甘油單酸酯，并釋放2 個脂肪酸[19]。LOX 蛋白能夠催化游離的不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化自由基，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，引起機(jī)體代謝紊亂[3]?？梢奓IP2和LOX2兩個基因與脂肪代謝非常相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過40 d 的光照貯藏，與綠光相比，在紅光和藍(lán)光貯藏條件下，大白菜的LIP2和LOX2基因表達(dá)量明顯降低，脂肪代謝水平較低。因此，在紅光和藍(lán)光貯藏條件下，大白菜的總脂肪含量可以保持較高水平。但是紅光和藍(lán)光哪種更適合大白菜脂類物質(zhì)的保持，還有待于進(jìn)一步研究?？傊?，用紅光和藍(lán)光對大白菜進(jìn)行貯藏，有利于大白菜脂肪的保持，也有利于延長大白菜的貨架期，提高大白菜的貯藏品質(zhì)。