李艷艷， 馮亞平， 柯 金， 龍 星

（武漢大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，湖北 武漢 430079）

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎 （temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨退行性改變和滑膜炎癥為主要病理特征的慢性疾病，會導(dǎo)致關(guān)節(jié)區(qū)疼痛、張口受限，甚至面部畸形，嚴(yán)重影響患者的日常生活[1]。 近來的研究表明，滑膜炎與關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的退行性病變密切相關(guān)[2-3]。 因此，研究TMJOA 患者滑膜炎性分子表達的變化也尤為重要。

NLRP3 炎癥小體 （NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3 inflammasome）是NOD 樣受體 （nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）家族的重要成員，存在于細胞質(zhì)中。NLRP3 炎癥小體由NLRP3、 凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和胱天蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-1）前體3 種蛋白組成。 NLRP3 受到刺激，構(gòu)象發(fā)生改變而活化， 與ASC 通過熱蛋白結(jié)構(gòu)域連接，招募pro-Caspase-1 通過胱天蛋白募集域連接ASC和pro-Caspase-1， 產(chǎn) 生 活 化 的Caspase-1 p10 和Caspase-1 p20， 隨后將pro-IL-1β 和pro-IL-18 剪切為活化和分泌形式的IL-1β 和IL-18，細胞因子啟動或者擴增不同的下游信號通路，導(dǎo)致炎癥的級聯(lián)放大[4]。 NLRP3 炎癥小體的活化在許多疾病，如IgA 腎病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RS）等的病理發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[5-6]。 然而，目前還不清楚在TMJOA 滑膜炎中是否涉及NLRP3/Caspase-1/IL-1β 軸的活化。 因此，本實驗將對顳下頜關(guān)節(jié)滑膜細胞中的NLRP3 和Caspase-1 的表達進行研究，以期進一步闡明TMJOA 的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1取材 在患者知情同意情況下采集滑膜樣本，研究方案經(jīng)武漢大學(xué)口腔醫(yī)院批準(zhǔn)。 取8 例根據(jù)臨床表現(xiàn)、 口腔檢查和影像學(xué)檢查確診為TMJOA，并需要進行關(guān)節(jié)手術(shù)患者的滑膜組織，其中男性，3 例，女性，5 例，另取3 例髁突肥大患者的滑膜組織作為對照組，患者年齡均在20～55 歲。

1.1.2主要試劑 磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffer saline，PBS）、高糖培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清（Hyclone 公司，美國）；RIPA（radio immunoprecipitation assay）裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（Biosharp 公司，中國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol 試劑（TaKaRa 公司，日本）；兔抗NLRP3 單克隆抗體、 兔抗Caspase-1 單克隆抗體和羊抗兔二抗（Abcam 公司，美國）；鼠抗肌球蛋白（β-actin）多克隆抗體和羊抗鼠二抗（武漢三鷹生物技術(shù)在限公司， 中國）； 增強發(fā)光法 （enhanced chemiluminescenece，ECL）顯影液（上海碧云天公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1滑膜細胞的培養(yǎng) 根據(jù)蔡恒星等[7]的經(jīng)驗方法進行滑膜細胞分離和培養(yǎng)，注意無菌操作。 具體步驟： 用含100 U/mL 鏈霉素和100 mg/L 青霉素的無菌PBS 沖洗取材組織，直至溶液澄清。 將其剪成1 mm×2 mm 大小的組織塊， 置于25 mL 培養(yǎng)瓶的瓶底， 使其分散均勻。 用含有20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基潤濕組織塊， 于37 ℃、95%O2和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察并換液，待細胞生長融合至密度達80%左右進行傳代。

1.2.2實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）法測定滑膜組織中NLRP3 和Caspase-1 mRNA 的表達 取培養(yǎng)3 代以內(nèi)的滑膜細胞，PBS 沖洗3 遍后加入Trizol試劑，置于搖床上5 min，將提取的總RNA 轉(zhuǎn)移到無酶微型離心管中并檢測純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒上的說明合成模板cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq進行RT-PCR。 引物以β-actin 為內(nèi)參，引物序列見表1。反應(yīng)條件：①95 ℃30 s；②PCR 反應(yīng)，GOTO：39（40 Cycles），60 ℃30 s；③熔解曲線，每例樣品設(shè)置3 個平行復(fù)孔， 按照2-ΔΔCt法獲得滑膜細胞的NLRP3 和Caspase-1 基因表達量。

表1 RT-PCR 基因引物序列表Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.2.3Western blot 檢測滑膜細胞中NLRP3、Caspase-1 蛋白表達 取培養(yǎng)3 代以內(nèi)的滑膜細胞，PBS 洗滌3 次，吸干，加入RIPA 裂解液反應(yīng)，迅速刮下細胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷離心管中，以上操作均在冰上進行。 在4 ℃下14 000×g離心10 min 收集蛋白，檢測蛋白濃度。 加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，振蕩器上振蕩均勻，在95 ℃加熱裝置上變性蛋白。洗凈并晾干玻璃板后垂直夾緊，放置并灌膠，待膠凝固后，每孔加入20 μg 的蛋白樣品，然后電泳分離蛋白。 將蛋白從膠中電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（poly-vinylidene fluoride，PVDF）膜 上。 根 據(jù)NLRP3、Caspase-1 和β-actin 的蛋白分子量將PVDF 膜切成條帶， 置于洗凈并標(biāo)記好的盒子里，TBST 漂洗5 min。 加入封閉緩沖液室溫搖動60 min，TBST 漂洗3 次， 每次5 min。按標(biāo)記加入新鮮配制的一抗， 分別是兔抗NLRP3單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗Caspase-1 單克隆抗體（1∶100）及鼠抗β-actin 多克隆抗體（1∶500），4 ℃中輕輕搖動過夜后，TBST 漂洗3 次，每次5 min。 加入新鮮配制的二抗，室溫搖動60 min，TBST 漂洗3 次，每次5 min。 加入增強發(fā)光顯影液ECL 后在掃描儀中成像， 用Image J 軟件分析條帶上的NLRP3 和Caspase-1 蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。 數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用獨立樣本t檢驗比較兩組的差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測結(jié)果

RT-PCR 的結(jié)果見圖1。 按照2-ΔΔCt法分析，NLRP3 和Caspase-1 mRNA 在TMJOA 滑膜細胞中的表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 RT-PCR 顯示NLRP3 和Caspase-1 基因在顳下頜關(guān)節(jié)滑膜細胞中的表達量Figure 1 The gene expression level of NLRP3 and Caspase-1 in TMJ synovial cells by RT-PCR

2.2 Western blot 檢測結(jié)果

Western blot 結(jié)果表明，TMJOA 滑膜細胞中NLRP3 和Caspase-1 的蛋白表達水平顯著高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 Western blot 檢測顳下頜關(guān)節(jié)滑膜細胞中NLRP3 和Caspase-1 的蛋白表達情況Figure 2 The protein expression of NLRP3 and Caspase-1 in TMJ synovial cells by Western blot

3 討論

多項研究認為滑膜炎出現(xiàn)在TMJOA 的各個時期，并且是導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和下頜運動障礙的重要原因[8]。 滑膜炎產(chǎn)生一系列促炎細胞因子，其中IL-1β和TNF-α 是研究最為廣泛的因子，在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的滑膜、滑液、關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨中均有升高，導(dǎo)致軟骨分解代謝[9]。

NLRP3/Caspase-1 炎癥復(fù)合體通路在固有免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，目前研究主要集中于免疫細胞。 本實驗分別從基因和蛋白2 個方面證明在TMJOA 患者的滑膜細胞中存在NLRP3 炎癥體和Caspase-1， 且兩者的表達與對照組相比顯著升高。 為進一步研究TMJOA 滑膜細胞中的NLRP3/Caspase-1 炎癥復(fù)合體的激活和調(diào)節(jié)打下基礎(chǔ)。

NLRP3 炎性小體的活化需要啟動和激活2 個連續(xù)步驟：第一步是通過Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）或者細胞因子識別病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和宿主源性的危險信號（danger-associated molecular patterns，DAMPs）， 激活NF-κB 信號通路， 啟 動NLRP3 炎性小體和IL-1β 等前體蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯；第二步是NLRP3 的激活劑觸發(fā)NLRP3 發(fā)生寡聚化并活化Caspase-1， 導(dǎo)致IL-1β 和IL-18 的加工和釋放。 同時，IL-1β 可作用于NF-κB 信號通路， 促進NLRP3 炎性小體通路的活化，從而導(dǎo)致正反饋級聯(lián)擴大效應(yīng)[10]。

目前關(guān)于NLRP3 炎性小體的激活， 普遍認同的機制包括線粒體活性氧的產(chǎn)生、 鉀離子外排流出、溶酶體膜的破壞導(dǎo)致組織蛋白酶釋放和細胞器的空間定位[11]。研究認為，巨噬細胞的胞外腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）激活細胞膜上的ATP-門控離子通道P2X7 嘌呤能受體，迅速打開K+通道外排K+，招募pannexin-1 半通道蛋白形成膜孔，使細胞外的NLRP3 激活劑進入細胞質(zhì)內(nèi)，直接激活NLRP3[12-13]，進而活化Caspase-1，釋放成熟的促炎因子IL-1β， 而IL-1β 可以刺激滑膜細胞釋放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）快速促炎，同時抑制軟骨細胞增殖， 降低蛋白多糖和膠原的合成，導(dǎo)致滑膜炎癥和軟骨的破壞[14]。以往研究得知顳下頜關(guān)節(jié)滑膜細胞包括A 型細胞和B 型細胞，A 型細胞為巨噬細胞樣細胞，B 型細胞為成纖維樣細胞[15]。 因此我們猜測，這種NLRP3 激活方式可能存在于TMJOA 的滑膜中并導(dǎo)致滑膜炎癥。

另外， 研究者們發(fā)現(xiàn)NLRP3/Caspase-1 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的同時介導(dǎo)一種新型細胞程序性壞死—細胞焦亡（pyroptosis）[16]。胞質(zhì)內(nèi)激活的NLRP3 炎癥體可以活化Caspase-1、 活性形式的Caspase-1 切割其底物gasdermin D（GSDMD）的N 端蛋白，釋放的N端蛋白結(jié)合細胞膜并寡聚形成孔道狀結(jié)構(gòu)，使細胞內(nèi)容物釋放，引起細胞離子濃度梯度消失和細胞滲透溶脹，觸發(fā)細胞焦亡[17]。細胞焦亡一方面對先天免疫防御至關(guān)重要，幫助機體應(yīng)對病原體感染，另一方面炎性小體異?；蜻^度活化與很多疾病相關(guān)。 近來許多研究認為細胞焦亡與肝組織、肺組織和滑膜組織等組織纖維化相關(guān)， 形成焦亡-慢性炎性反應(yīng)-纖維化軸樣病理過程。 有研究發(fā)現(xiàn)膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）的滑膜成纖維細胞和滑膜巨噬細胞均可在KOA 中發(fā)生細胞焦亡， 產(chǎn)生炎性因子，且通過轉(zhuǎn)染滑膜成纖維細胞沉默GSDMD 后，可顯著降低成纖維標(biāo)志物的表達，提示成纖維滑膜細胞焦亡介導(dǎo)滑膜炎癥反應(yīng)并加劇纖維化[18]。 本實驗發(fā)現(xiàn)TMJOA 患者的滑膜細胞中，NLRP3 和Caspase-1 的表達水平顯著升高，而NLRP3 和Caspase-1在細胞焦亡相關(guān)通路中發(fā)揮重要的作用，這些都提示細胞焦亡很可能參與了TMJOA 的發(fā)生、發(fā)展，這將是本課題下一步的研究目標(biāo)。