翟小菊 李松林 馬光 王國良 惠學志

[摘要] 目的 研究蟾毒靈對低氧/復氧（H/R）心肌細胞損傷的影響，并初步探究其作用機制。方法 體外建立H/R心肌細胞模型，并采用不同濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）的蟾毒靈處理。采用CCK-8法測定細胞活力，酶標法檢測超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量，流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率和活性氧（ROS）水平，Western blot檢測剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3和9（Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9）蛋白水平。結(jié)果 與空白對照組比較，H/R組心肌細胞活力、SOD含量明顯降低，ROS水平、MDA含量、細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達升高（F=129.978～330.050，P<0.05）。蟾毒靈可明顯改善H/R引起的上述指標變化。結(jié)論 蟾毒靈能夠改善H/R引起的心肌細胞損傷，其作用機制可能與抑制氧化應激和細胞凋亡有關。

[關鍵詞] 蟾酥堿;肌細胞，心臟;心肌再灌注損傷;活性氧;細胞凋亡

[中圖分類號] R996.3;R542.2[文獻標志碼] A[文章編號] 2096-5532（2021）01-0115-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of bufalin on hypoxia/reoxygenation （H/R）-induced cardiomyocyte injury and its mechanism of action. MethodsAn H/R cardiomyocyte model was established in vitro and cardiomyocytes were treated with bufalin at different concentrations （0.1， 1.0， and 10.0 μmol/L）. CCK-8 assay was used to determine cell viability; ELISA was used to measure the content of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA）; flow cytometry was used to measure cardiomyocyte apoptosis and reactive oxygen species （ROS） level; Western blot was used to measure the levels of cleaved cysteine-containing aspartate proteolytic enzymes 3 and 9 （cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9）. ResultsCompared with the blank control group， the H/R group had significant reductions in cardiomyocyte viability and SOD content and significant increases in ROS level， MDA content， apoptosis rate， and protein expression of cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 （F=129.978-330.050，P<0.05）. Bufalin significantly improved the above changes in these indices caused by H/R. ConclusionBufalin can improve cardiomyocyte injury caused by H/R， possibly by inhibiting oxidative stress and cell apoptosis.

[KEY WORDS]Bufotenin; myocytes， cardiac; myocardial reperfusion injury; reactive oxygen species; apoptosis

急性心肌梗死是冠狀動脈持續(xù)性缺血低氧引起的心肌壞死，當冠狀動脈血運重建時可能誘發(fā)缺血/再灌注損傷[1-2]。如何減少缺血/再灌注造成的心肌細胞損傷一直以來是心血管疾病臨床和基礎研究的重點。蟾毒靈是一種從傳統(tǒng)中藥蟾酥中提取的中藥單體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、強心、抗腫瘤等多種臨床功效[3-4]。有研究顯示，蟾酥能夠改善缺血心肌細胞的能量代謝，在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性地抑制大鼠心肌細胞收縮，減輕心肌損傷，對心肌具有保護作用[5-6]。然而，蟾毒靈在心肌缺血/再灌注損傷中是否發(fā)揮作用的研究鮮有報道。因此，本實驗通過體外構(gòu)建低氧/復氧（H/R）心肌細胞損傷模型，觀察蟾毒靈對H/R損傷心肌細胞的影響及機制，為利用蟾毒靈防治心肌H/R損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心肌細胞株H9c2購自中國科學院上海生命科學學院細胞資源中心;蟾毒靈（純度≥98%）購自煙臺靶點藥物研究有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自北京曠博生物技術有限公司;活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所; Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司;Western blot檢測所需試劑均購自上海碧云天生物技術研究所;剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3和9（Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9）抗體購自美國Santa Cruz公司;β-actin抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 H/R心肌細胞模型的構(gòu)建 在含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)心肌細胞H9c2，放置在體積分數(shù)0.05 CO2、0.95空氣、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照文獻方法構(gòu)建H/R心肌細胞模型[7]，待心肌細胞生長達60%左右融合時，除去舊培養(yǎng)液，加入不含血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液，將心肌細胞放置在體積分數(shù)0.95 N2和0.05 CO2培養(yǎng)箱中低氧處理12 h，取出細胞，棄去舊培養(yǎng)液，更換成含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，再將細胞放置在體積分數(shù)0.05 CO2、0.95空氣的培養(yǎng)箱中復氧處理4 h。

1.2.2 實驗分組 心肌細胞接種到6孔板中，將細胞隨機分為5組：空白對照組（A組），未經(jīng)任何處理正常培養(yǎng)的心肌細胞;H/R組（B組），按照上述1.2.1方法對心肌細胞進行H/R處理;低濃度蟾毒靈組（C組），以0.1 μmol/L蟾毒靈預處理心肌細胞12 h再行H/R處理;中濃度蟾毒靈組（D組），以1.0 μmol/L蟾毒靈預處理心肌細胞12 h再行H/R處理;高濃度蟾毒靈組（E組），以10.0 μmol/L蟾毒靈預處理心肌細胞12 h再行H/R處理。蟾毒靈處理濃度選擇依據(jù)文獻報道及前期預實驗結(jié)果[8]。

1.2.3 CCK-8檢測心肌細胞活力 將心肌細胞以每孔1×103個接種于96孔板中，置37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h，按照上述1.2.2方法分組處理心肌細胞，分別向每孔細胞中添加10 μL CCK-8試劑和100 μL無血清培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h，采用酶標儀測定450 nm波長處各孔心肌細胞光密度值（OD值）。計算各組心肌細胞活力（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.4 酶標法檢測細胞內(nèi)SOD和MDA含量 各組心肌細胞處理后，棄去培養(yǎng)液分別收集細胞，使用磷酸緩沖液洗滌細胞，通過超聲破碎儀破碎細胞，以3 500 r/min低溫離心10 min，收集上清，分別按照試劑盒說明書進行處理。采用多功能酶標儀測定各組心肌細胞內(nèi)SOD和MDA含量。

1.2.5 流式細胞術檢測各組心肌細胞凋亡率 各處理組心肌細胞以胰蛋白酶消化后，離心收集細胞，用預冷的磷酸緩沖液洗滌細胞。按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒使用說明書進行操作，加入1×Binding buffer重懸細胞100 μL，再向細胞懸液中加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μL，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min。使用流式細胞儀測定各組心肌細胞凋亡率。

1.2.6 流式細胞術檢測ROS水平 將熒光探針DCFH-DA以不含血清的培養(yǎng)液稀釋。各處理組心肌細胞除去培養(yǎng)液，分別加入稀釋的DCFH-DA，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，用不含血清的培養(yǎng)液洗滌細胞3次，除去DCFH-DA。收集各組細胞上流式細胞儀使用488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長檢測熒光強度。

1.2.7 Western blot檢測各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平 分別收集各組處理后的心肌細胞，向細胞中加入RIPA裂解液，冰上提取總蛋白。以BCA蛋白濃度測定試劑盒對提取蛋白進行定量，調(diào)整蛋白濃度，取等量蛋白加入到各上樣孔中，采用SDS-PAGE凝膠進行電泳，電泳結(jié)束后將各組蛋白采用半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中孵育2 h，取出膜使用TBST洗滌3次，每次10 min，再加入稀釋的相應一抗，Cleaved Caspase-3和-9一抗均為1∶800稀釋，4 ℃過夜孵育。以TBST洗滌3次，每次10 min，再加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育1 h。以TBST洗滌3次，每次10 min，在暗室中加入ECL化學發(fā)光液進行顯影，曝光，采用凝膠成像儀拍照。以β-actin為內(nèi)參照，采用Quantity One圖像分析軟件統(tǒng)計各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異比較采用SNK-q檢驗分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細胞活力比較

CCK-8檢測結(jié)果顯示，A～E組心肌細胞活力分別為（100.00±5.01）%、（39.84±2.12）%、（49.28±3.44）%、（64.71±4.81）%和（87.01±4.69）%。與A組比較，B組心肌細胞活力顯著下降（F=330.050，q=43.377，P<0.05）;與B組相比較，C、D、E組心肌細胞活力有不同程度的升高（q=6.804～34.011，P<0.05）。提示隨蟾毒靈濃度的增加心肌細胞活力逐漸升高。

2.2 各組心肌細胞內(nèi)ROS水平、SOD和MDA含量比較

酶標法和流式細胞術檢測結(jié)果顯示，與A組比較，B組心肌細胞內(nèi)SOD含量降低（F=129.978，q=28.673，P<0.05），ROS水平和MDA含量升高（F=171.502、178.726，q=33.623、31.443，P<0.05）;與B組比較，C、D、E組心肌細胞內(nèi)SOD含量隨藥物濃度的增加而增加（q=4.144～17.689，P<0.05），ROS水平和MDA含量隨藥物濃度的增加而降低（q=7.893～27.065，P<0.05）。見圖1。

2.3 各組心肌細胞凋亡率比較

流式細胞術檢測結(jié)果顯示，A～E組心肌細胞凋亡率分別為（3.81±0.66）%、（35.69±5.35）%、（27.04±3.29）%、（18.48±2.84）%和（9.26±1.15）%。與A組比較，B組心肌細胞凋亡率顯著升高（F=152.747，q=30.467，P<0.05）;與B組比較，C、D、E組心肌細胞凋亡率隨藥物濃度的增加逐漸降低（q=8.267～25.259，P<0.05）。見圖2。

2.4 各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，與A組比較，B組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平均明顯上調(diào)（F=211.749、217.378，q=32.577、37.566，P<0.05）;與B組比較，C、D、E組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平隨藥物濃度的增加逐漸下調(diào)（q=6.831～25.469，P<0.05）。見圖3。

3 討論

急性心肌梗死是常見的心血管疾病，美國每年約有150萬人發(fā)病[9]。近年來，我國急性心肌梗死的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，嚴重危害著人類的健康和生命[10]。臨床上常通過血運重建的方式縮小梗死面積，挽救心肌，但血運重建會導致缺血/再灌注損傷的發(fā)生。目前關于心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生機制尚未徹底闡明，認為可能與氧自由基的作用、細胞凋亡過程紊亂、細胞內(nèi)鈣超載和白細胞的激活等相關[11-14]。研究證實，細胞凋亡過程的紊亂是病理性的，而且與Caspase基因有關[15]。在目前用于心肌缺血/再灌注損傷的新型治療劑中，各種天然植物化學物質(zhì)可通過各種途徑對心肌損傷起保護作用[16-17]。研究已證實，蟾酥提取物對心力衰竭、缺血性心肌病和高血壓等心血管疾病的治療具有重要作用[18-20]。作為蟾酥中的有效化學物質(zhì)，蟾毒靈具有多種生物活性。本實驗通過建立H/R心肌細胞損傷模型，探究蟾毒靈對心肌細胞損傷的影響及機制。

在預實驗中依據(jù)文獻報道篩選蟾毒靈的作用濃度[8]，研究結(jié)果顯示，當蟾毒靈濃度≤10.0 μmol/L時，能夠促進心肌細胞增殖活性;當蟾毒靈濃度>30.0 μmol/L時，則抑制心肌細胞增殖活性。因此，本實驗根據(jù)預實驗結(jié)果選擇0.1、1.0、10.0 μmol/L為實驗加藥濃度。本文結(jié)果表明，H/R損傷顯著降低了心肌細胞的活力，而蟾毒靈明顯逆轉(zhuǎn)了H/R誘導的細胞活力降低。越來越多的研究結(jié)果已經(jīng)證實，氧化應激在心肌缺血/再灌注損傷中起關鍵作用[21-23]。心肌細胞中的氧化劑和抗氧化劑失衡有利于ROS積累，導致細胞損傷，引起氧化應激[24]。已證明，在心肌缺血/再灌注損傷期間ROS水平增加，內(nèi)源性自由基清除酶如SOD活性降低[25-27]。眾所周知，活性醛如MDA是氧化應激最常見的產(chǎn)物和毒性標志物之一。心肌缺血/再灌注損傷促進氧化應激，引起活性醛積累，導致心臟損傷[28]。因此，通過檢測心肌細胞中ROS水平、SOD活性以及MDA含量能夠顯示心肌細胞的氧化損傷程度。本實驗酶標法檢測結(jié)果顯示，蟾毒靈處理的心肌細胞內(nèi)SOD活性增加，ROS和MDA含量減少，且具有濃度依賴關系。這些結(jié)果提示，蟾毒靈對H/R條件下心肌細胞氧化應激損傷具有保護作用。

心肌細胞凋亡過程的紊亂被認為是心肌缺血/再灌注損傷的主要病理生理機制之一，并且被認為是導致心肌缺血/再灌注損傷后細胞死亡的重要原因[29]。本研究流式細胞術檢測顯示，蟾毒靈處理組的心肌細胞凋亡率明顯低于H/R處理組，且隨著蟾毒靈濃度的升高，心肌細胞凋亡率逐漸降低，表明蟾毒靈能夠呈濃度依賴性地抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡。此外，本文Western blot檢測顯示，蟾毒靈處理組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平明顯低于H/R處理組。Caspase-3和-9作為半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族成員，在細胞凋亡中起關鍵作用。特定位點的切割將激活Caspase-3和-9并促進細胞凋亡[30]。本文結(jié)果提示，蟾毒靈可能通過下調(diào)Cleaved Caspase-3和-9的蛋白表達抑制心肌細胞凋亡，對H/R心肌細胞損傷起保護作用。

總之，本研究的結(jié)果揭示了蟾毒靈對H/R損傷心肌細胞具有保護作用，其作用機制與降低氧化應激及細胞凋亡有關。初步證實蟾毒靈的心肌保護作用和潛在機制，這些結(jié)果為體內(nèi)作用進一步評估提供了證據(jù)，這可能有助于開發(fā)新的治療急性心肌梗死的方法。本實驗初步探究蟾毒靈是否對H/R心肌細胞起保護作用，其作用效果在何種水平尚未可知，后期實驗將設置已知有效藥物的陽性對照組，以更深入明確其作用的分子機制。此外，為更充分了解蟾毒靈作用，需增加H/R后蟾毒靈不同濃度和不同時間點對細胞作用，闡述蟾毒靈是否在發(fā)病后有一定的抑制氧化、凋亡和促進修復的作用。

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（本文編輯 于國藝）