張想，李立郎，楊娟*，楊小生，廖秀，沈曼筠

1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院（貴陽 550025）；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴陽 550014）

刺梨（Rosa roxbughiiTratt）是薔薇科薔薇屬多年落葉灌木繅絲花的果實(shí)[1]，原產(chǎn)于中國西南地區(qū)[2]。刺梨含有多糖、維生素、膳食纖維、有機(jī)酸及各種人體必需的氨基酸、微量元素等，且具有抗氧化、抗癌防癌，降血糖、降血脂、健胃等藥用價(jià)值[3-5]。在刺梨的食品加工過程中有近50%的殘?jiān)粊G棄[6]，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。刺梨果渣中含有豐富的粗蛋白、維生素和粗纖維等[7]，有很高的再利用價(jià)值。膳食纖維（DF）被稱為“第七大營養(yǎng)素”[8]，因具有抗癌、抗氧化、降低膽固醇、改善胃腸健康、預(yù)防心血管疾病等作用[9-12]而備受關(guān)注。

膳食纖維的提取方法主要有化學(xué)法、酶法、物理法、發(fā)酵法等[13]。其中，微生物發(fā)酵法對(duì)可溶性膳食纖維有較好的改性效果[14]，且具有易操作、成本低、污染小、得率高等優(yōu)點(diǎn)[15]。平菇類木腐菌能產(chǎn)生一些多酚氧化酶和纖維素酶來降解刺梨果渣中的木質(zhì)纖維作為自身碳源，刺梨果渣含有大量有機(jī)酸物質(zhì)，pH呈弱酸性，適用于平菇等木腐菌類生長[16]，其中的粗蛋白、糖類和粗纖維等物質(zhì)可作為真菌生長所必備的氮源和碳源[17]。

為實(shí)現(xiàn)刺梨果渣高值化利用，試驗(yàn)以刺梨果渣為原料，以平菇為發(fā)酵菌種，采用單因素結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化法[18]，探究平菇發(fā)酵提取刺梨果渣中膳食纖維的最佳工藝參數(shù)，旨在提高刺梨果渣中膳食纖維含量；通過氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)最佳發(fā)酵工藝處理前后的氨基酸含量變化，為更好地開發(fā)利用高質(zhì)量功能產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨果渣（貴州恒力源天然生物科技有限公司提供，新鮮刺梨經(jīng)榨汁等加工后的副產(chǎn)物，干燥處理后備用）；平菇一級(jí)種（貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、CaCl2、KCl、丙酮（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶、MES-TRIS（大連美侖生物科技有限公司）。

PDA培養(yǎng)基[19]：200 g馬鈴薯切片，加熱煮沸，過濾，加入20 g葡萄糖和18 g瓊脂，再次加熱煮沸10 min，調(diào)整體積至1 L后用玻璃棒攪拌溶化均勻后分裝試管，在121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌30 min，冷凝后待用。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀（日本HITICHI公司）；DK-98-II恒溫振蕩水浴箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA2004N分析天平（上海菁海儀器有限公司）；SX2-4-10TZ馬弗爐（廈門儀宸科技有限公司）；101-2A烘箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；BZF-50真空干燥箱（常州諾基儀器有限公司）；FE20 pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LDZV-75KBS不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

在無菌條件下將保藏良好的平菇菌種母種接種到制備好的PDA斜面固體培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱種恒溫培養(yǎng)5～7 d，采用上述方法活化3次。

1.3.2 工藝流程

新鮮刺梨果渣→調(diào)料混勻、配制發(fā)酵培養(yǎng)基→裝瓶、滅菌（121 ℃，30 min）→冷卻后接入活化好的平菇菌種→發(fā)酵培養(yǎng)（26 ℃條件下，培養(yǎng)至菌絲體長滿培養(yǎng)基即為發(fā)酵完全）→滅菌→烘干→粉碎（過孔徑0.074 mm篩）→平菇發(fā)酵刺梨果渣膳食纖維測(cè)定

1.3.3 單因素試驗(yàn)

參照1.3.2的膳食纖維提取工藝流程，選取氯化鈣添加量、氯化鉀添加量、糖含添加量、液料比4個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，以刺梨果渣膳食纖維得率為指標(biāo)，研究平菇發(fā)酵在不同條件下對(duì)刺梨果渣膳食纖維得率的影響，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1）。

表1 刺梨果渣膳食纖維單因素試驗(yàn)水平表

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert 8.06軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選擇氯化鈣添加量（A）、氯化鈣添加量（B）、糖添加量（C）、液料比（D）為自變量，平菇發(fā)酵SDF得率為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素的3個(gè)水平采用-1，0和1進(jìn)行編碼，見表2。

表2 響應(yīng)面因素及編碼水平

1.3.5 刺梨果渣膳食纖維提取率的測(cè)定

根據(jù)GB 5009.88—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測(cè)定》中所示的酶重量法對(duì)原料的總膳食纖維（TDF）含量、不溶性膳食纖維（IDF）含量及可溶性膳食纖維（SDF）含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 氨基酸的測(cè)定

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》，準(zhǔn)確稱取1.000 0 g樣品，加入10 mL的6 mol/L鹽酸于水解管中，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口，將已封口的水解管放在110±1 ℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22 h后，取出冷卻至室溫。打開水解管，將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶?jī)?nèi)，用1.0 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖液溶解，振蕩混勻后過0.22 μm濾膜后，轉(zhuǎn)移至儀器進(jìn)樣瓶，為樣品測(cè)定液?；旌习被針?biāo)準(zhǔn)工作液和樣品測(cè)定液分別以相同體積注入氨基酸分析儀，以外標(biāo)法通過峰面積計(jì)算樣品測(cè)定液中氨基酸的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

數(shù)據(jù)以x±SD表示，利用Excel 2018進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，以p＜ 0.05為差異顯著，Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 氯化鈣（CaCl2）添加量對(duì)平菇發(fā)酵刺梨果渣DF得率的影響

由圖1可知，氯化鈣添加量0.6%～1.0%時(shí)IDF得率逐漸上升，1.0%時(shí)達(dá)到最大；之后IDF得率逐漸減??；隨著氯化鈣添加量增加，SDF得率均呈逐漸增加趨勢(shì)；氯化鈣添加量達(dá)到1%時(shí)，SDF得率達(dá)到最大值；繼續(xù)增加其含量，SDF得率反而都下降。不同濃度的鈣離子對(duì)食用菌菌絲生長有著不同程度影響[20]，鈣離子可以促進(jìn)平菇菌絲生長，因菌絲體生長速度、數(shù)量增加，SDF得率逐漸增加。但隨著鈣離子濃度增高，菌絲體對(duì)鈣的吸收率降低，菌絲生長受到抑制，導(dǎo)致SDF得率降低，故采用平菇發(fā)酵刺梨果渣氯化鈣最佳添加量均為1.0%。

圖1 CaCl2添加量對(duì)平菇發(fā)酵刺梨果渣DF得率的影響

2.1.2 氯化鉀（KCl）添加量對(duì)平菇發(fā)酵刺梨果渣DF的影響

鉀元素是真菌生命活動(dòng)不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)之一[21]，在調(diào)節(jié)代謝、維持離子穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)滲透壓等眾多生命過程中發(fā)揮重要作用[22-23]。由圖2可知，氯化鉀添加量對(duì)IDF的得率影響作用不大。氯化鉀添加量小于0.6%時(shí)，菌絲的生長受到抑制作用；而在氯化鉀添加量0.6%時(shí)SDF得率均為最大值；培養(yǎng)基中鉀離子濃度過高會(huì)導(dǎo)致菌絲細(xì)胞內(nèi)外滲透壓和酸堿平衡失調(diào)，所以SDF得率隨著氯化鉀添加量增加而降低。故采用平菇發(fā)酵刺梨果渣氯化鉀最佳添加量均為0.6%。

圖2 KCl添加量對(duì)平菇發(fā)酵刺梨果渣DF得率的影響

2.1.3 糖添加量對(duì)平菇發(fā)酵刺梨果渣DF的影響

菌種生長過程中受到碳源、氮源種類及濃度等因素影響[24]。由圖3可知，糖添加量4%時(shí)，IDF得率均達(dá)到最高值；糖添加量超過4%時(shí)，IDF提取率隨糖添加量升高而減小；糖添加量在2%～4%范圍內(nèi)，由于培養(yǎng)基中碳源增加，有利于菌種生長發(fā)育，SDF得率得以提高；糖添加量4%時(shí)SDF得率均得到最大值；繼續(xù)增大糖添加量，導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)碳氮比例失調(diào)，引起菌絲停止生長或生長緩慢，故SDF得率逐漸降低。因此采用平菇發(fā)酵刺梨果渣糖最佳添加量均為4.0%。

圖3 糖添加量對(duì)平菇發(fā)酵刺梨果渣DF的影響

2.1.4 液料比對(duì)平菇發(fā)酵刺梨果渣DF得率的影響

在提取過程中適當(dāng)?shù)囊毫媳饶茉诩?xì)胞內(nèi)外形成較大的濃度差，有利于DF的溶出，但是過高的液料比會(huì)阻礙DF的溶出，而過低的液料比不利于溶出[25]。由圖4可知，刺梨果渣IDF得率隨液料比增加而變大，液料比為7∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大值，此后IDF得率呈下降趨勢(shì)。液料比＜7∶1（mL/g）時(shí)，不利于菌種發(fā)酵，SDF提取不完全，得率較低；液料比為7∶1（mL/g）時(shí)，SDF得率都達(dá)到最高值；液料比繼續(xù)增加，由于刺梨果渣中SDF含量有限，故溶出率不再增加。因此，采用平菇發(fā)酵刺梨果渣最佳液料比均為7∶1（mL/g）。

圖4 液料比對(duì)平菇發(fā)酵刺梨果渣DF得率的影響

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析結(jié)果

2.2.1 平菇發(fā)酵刺梨果渣的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)表2中的編碼與水平進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見表3。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元擬合回歸，得到回歸方程：Y（平菇發(fā)酵SDF得率）=7.24+0.36A+0.25B+0.40C+0.29D-0.19AB-0.20AC-0.12AD-0.19BC-0.26BD-0.100CD-0.75A2-0.50B2-0.44C2-0.58D2。

表3 平菇發(fā)酵刺梨果渣響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 平菇發(fā)酵刺梨果渣中可溶性膳食纖維得率的回歸模型方差分析

由表3可知，因受到不同因素及其添加量的影響，平菇發(fā)酵刺梨果渣SDF得率有所不同。對(duì)響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果建立模型，方差分析結(jié)果見表4，可知該模型p＜0.000 1，說明此模型真實(shí)可靠。失擬項(xiàng)的p=0.060 8，模型的失擬度差異不顯著。因此，該模型的擬合程度比較好。相關(guān)系數(shù)R2=0.982 9，說明模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合情況接近。

2.2.2 平菇發(fā)酵刺梨果渣響應(yīng)面結(jié)果分析

根據(jù)回歸方程，各因素及其交互作用下對(duì)平菇發(fā)酵刺梨果渣SDF得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖5所示。三維響應(yīng)面可以反映每?jī)蓚€(gè)因素之間的交互作用，等高線形狀越趨于橢圓形，表明其交互作用越明顯。從圖5可以看出，氯化鉀與液料比之間的響應(yīng)面曲線較為陡峭，而且等高線接近橢圓形，兩因素之間交互作用最為明顯，與方差分析結(jié)果一致；因此可得，影響平菇發(fā)酵刺梨果渣SDF得率的主次因素順序?yàn)樘翘砑恿浚–）＞氯化鈣添加量（A）＞液料比（D）＞氯化鉀添加量（B）。

2.2.3 平菇發(fā)酵刺梨果渣SDF得率最佳提取條件優(yōu)化與驗(yàn)證

由響應(yīng)面分析可得，平菇發(fā)酵刺梨果渣SDF提取最佳工藝參數(shù)為：氯化鉀添加量0.63%、氯化鈣添加量1.02%、糖添加量4.37%、液料比7.09∶1（mL/g）。在此條件下SDF得率理論值可達(dá)7.39%?？紤]到試驗(yàn)操作的可行性，將提取工藝參數(shù)修正為：氯化鉀添加量0.6%、氯化鈣添加量1.0%、糖添加量4.0%、液料比7.0∶1（mL/g）。在此條件下重復(fù)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，SDF得率為7.29%±0.05%，與理論值大致一致。證明該模型是可行真實(shí)的，具有實(shí)用價(jià)值。

圖5 各因素交互作用對(duì)平菇發(fā)酵刺梨果渣SDF得率影響的響應(yīng)面圖

2.2.4 游離氨基酸的含量與分析

人體所需氨基酸主要包括必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA），而必需氨基酸必須從體外攝取，所以必需氨基酸的含量和構(gòu)成比例是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的重要標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)酵前后刺梨果渣中氨基酸的含量見表5。由表5可知，發(fā)酵過程增加刺梨果渣中游離氨基酸的含量，游離氨基酸含量由0.234 6 mg/mL增加至1.083 9 mg/mL。氨基酸作為機(jī)體營養(yǎng)的第一要素，不僅直接或間接參與各種生命活動(dòng)，還在食物、食品品質(zhì)方面起到重要作用。食物蛋白營養(yǎng)價(jià)值的優(yōu)劣主要取決于所含必須氨基酸的種類、數(shù)量和組成比例，其組成比例越接近人體需要氨基酸的比例，則其質(zhì)量就越優(yōu)[26]。經(jīng)平菇發(fā)酵后的刺梨果渣中必需氨基酸的含量比新鮮果渣高11倍，這表明，發(fā)酵過程顯著提高必需氨基酸含量，使刺梨果渣更具營養(yǎng)價(jià)值。

自然界中氨基酸有20余種，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、賴氨酸9種氨基酸一般在植物中含量少，而且有些在人體內(nèi)不能合成，但又是維持機(jī)體平衡所必需的重要物質(zhì)，稱為藥用氨基酸[27]。谷氨酸作為神經(jīng)中樞及大腦皮質(zhì)的補(bǔ)劑，對(duì)于治療腦振蕩或神經(jīng)損傷、癲癇以及對(duì)弱智兒童均有一定療效，又能預(yù)防和治療肝昏迷，保護(hù)肝臟，是肝臟疾病患者的輔助藥物[28]。精氨酸是鳥氨酸循環(huán)中的一個(gè)組成成分，具有極其重要的生理功能，有助于將血液中的氨轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩囟判钩鋈?，故?duì)高氨血癥、肝臟機(jī)能障礙等均有功效，具有提高機(jī)體免疫力的作用[29]。天冬氨酸對(duì)增強(qiáng)肝功，緩解疲勞，預(yù)防心臟病、高血壓等疾病起到重要作用[30]。發(fā)酵后刺梨果渣中藥用氨基酸占TAA含量的68%左右。因此富含各種藥用氨基酸的發(fā)酵刺梨果渣可作為藥用價(jià)值較高的植物蛋白資源。

表5 發(fā)酵前后刺梨果渣中氨基酸的含量

3 結(jié)論與討論

刺梨果渣中雖富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，但存在適口性差、消化率低等缺點(diǎn)，而微生物發(fā)酵法可減少果渣中纖維素、木質(zhì)素、植酸、果膠、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)成分，同時(shí)提高其粗蛋白、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)含量，改善果渣的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)價(jià)值，提高其利用率。試驗(yàn)采用食用菌發(fā)酵法提取刺梨果渣中膳食纖維，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化SDF得率，結(jié)合實(shí)際分析得到平菇發(fā)酵刺梨果渣提取SDF最佳工藝條件：氯化鈣添加量1%、氯化鉀添加量0.6%、糖添加量4%、液料比7∶1（mL/g）。在此條件下，平菇發(fā)酵SDF得率為7.33%，高于未接種菌種的新鮮刺梨果渣可溶性膳食纖維得率（用酶法提取測(cè)得SDF得率約1.83%），為發(fā)酵刺梨果渣SDF得率最高值。且經(jīng)發(fā)酵工藝優(yōu)化后的刺梨果渣中總游離氨基、必需氨基酸及藥用氨基酸含量顯著提高，增加刺梨果渣的營養(yǎng)價(jià)值。果渣作為一種來源豐富而又經(jīng)濟(jì)的資源，綜合開發(fā)利用刺梨果渣，既能提高果渣利用價(jià)值，延長果渣加工產(chǎn)業(yè)鏈，又能減少對(duì)環(huán)境的污染。運(yùn)用食用菌發(fā)酵制備膳食纖維不僅工藝簡(jiǎn)便，提取條件溫和，所得膳食纖維質(zhì)量較好，而且具有可食用性，發(fā)酵后果渣營養(yǎng)成分更高。這不僅豐富刺梨果渣的加工產(chǎn)品，提高其利用率，還對(duì)刺梨果渣的開發(fā)和綜合利用提供理論參考。