楊秀峰，魏金超，高玉梅，陳芮*

1.云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院（昆明 650500）；2.中國科學(xué)院化學(xué)研究所（北京 100190）

瑪咖（學(xué)名為Lepidium meyeniiWalp，西班牙語又稱Maca）是一種原產(chǎn)于南美洲的十字花科植物，現(xiàn)已成功引種于中國云南、新疆、西藏等地區(qū)[1]?，斂ё鳛橐环N純天然食品，富含高單位營養(yǎng)素，具有滋補強身的功效。Dini等[2]曾報道瑪咖干根中含有的功效成分為多糖、生物堿、芥子油苷及多酚類物質(zhì)等。研究發(fā)現(xiàn)：瑪咖中還含有兩種次生代謝物——瑪咖酰胺和瑪咖烯，它們是瑪咖中特有的活性成分[3-4]。此外，瑪咖還具有抗疲勞[5]、增強細(xì)胞免疫功能[6]、抗氧化及提高生育能力等功效[7]。

多糖是由超過10個單糖的糖苷鍵結(jié)合成糖鏈而形成的高分子碳水化合物，是一種廣泛存在于高等植物、動物細(xì)胞膜、微生物的細(xì)胞壁中的天然大分子物質(zhì)，也是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一[8]?，斂Ф嗵亲鳛楝斂е械挠行С煞种唬哂锌鼓[瘤、提高生育能力、降血糖等作用[9]，此外還具有重要的生物活性，如較強的自由基清除能力[10-12]，對酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷及環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠具有保護作用[13-14]；抗疲勞活性[15]及增強免疫活性等[16-17]?，斂Ф嗵且驗槠鋬?yōu)異的生物活性已受到眾多學(xué)者的青睞。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多糖的提取技術(shù)越來越多樣化，從最傳統(tǒng)的溶劑萃取法發(fā)展到酶法，隨后引入超聲輔助法和微波輔助法[18-20]，再到超臨界萃取技術(shù)的應(yīng)用[21]。對于瑪咖多糖，傳統(tǒng)的提取方法為熱水、堿水和酸水浸提法等，研究報道超聲輔助提取和三相萃取法等提取手段也被應(yīng)用于瑪咖多糖的提取[22-24]。正交試驗設(shè)計法能夠?qū)崿F(xiàn)以最少的試驗次數(shù)達(dá)到與大量全面試驗等效的結(jié)果，因此被認(rèn)為是一種高效、快速、經(jīng)濟的多因素多水平的試驗設(shè)計方法。擬用水提法來測定瑪咖中多糖的含量。在單因素研究的基礎(chǔ)上通過正交試驗設(shè)計法對瑪咖中多糖的提取過程進(jìn)行優(yōu)化。

1 試劑與儀器

1.1 材料與試劑

試驗所用的試劑均為分析純；麗江瑪咖，云南省昆明市豐熙茶行提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000s型紫外-可見分光光度計，上海菁海儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 瑪咖多糖的提取過程

瑪咖干粉→水浴提取→離心分離，收集上清液→熱水洗滌沉淀，收集上清液→合并上清液→多糖含量的計算

2.2 葡萄糖儲備液的配制

精確稱取0.010 0 g葡萄糖，用水溶解后定容至100 mL，配制成0.100 mg/mL的葡萄糖儲備液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 瑪咖干粉中多糖含量的計算

多糖含量采用苯酚-硫酸法[25]測定，結(jié)合葡萄糖溶液工作曲線按照（1）計算：

式中：W為試樣的質(zhì)量，mg；C為葡萄糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；D為稀釋因子；F為換算因子。

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳波長的選擇

吸取1 mL葡萄糖儲備液，補充水分至2 mL，加入1 mL 6%的苯酚，迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，冷水中冷卻。以蒸餾水為空白對照，于300～600 nm測定吸光度。該溶液在此范圍內(nèi)的最大吸收波長即為測定樣品的最佳波長。由圖1可知，樣品在300～600 nm處出現(xiàn)了2個吸收峰，對應(yīng)的波長分別為325和490 nm。490 nm對應(yīng)的吸收峰的強度明顯地強于325 nm的吸收峰，故試驗選擇490 nm為測定的最佳波長。這一試驗結(jié)果與王金全[26]在瑪咖多糖提取工藝的研究試驗中選擇的最佳波長一致。

圖1 0.100 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外-可見吸收光譜圖

3.2 儀器精密度試驗

吸取6份葡萄糖儲備液于10 mL比色管中，利用苯酚-硫酸法測量吸光度檢測所用紫外-可見吸收光譜儀的精密度。如表1所示，平行試驗6次，測得葡萄糖溶液在490 nm的吸光度無明顯變化，δRSD為2.04%。這一結(jié)果表明試驗所用儀器精密度良好。

表1 儀器精密度試驗結(jié)果（n=6）

3.3 工作曲線的繪制

分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL葡萄糖儲備液，配制過程同最佳波長的選擇所用溶液的配制過程。測定490 nm的吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。如圖2所示，在0.02～0.06 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性回歸方程為A=14.616 7C+0.046 21，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。結(jié)果表明：在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的性線關(guān)系。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線

3.4 換算因子的測定

稱取0.010 0 g干燥至恒質(zhì)量的瑪咖多糖，溶解并定容至100 mL。吸取2 mL于10 mL比色管中，加入1 mL 6%的苯酚溶液，加入5 mL濃硫酸，煮沸15 min后于冷水中冷卻，在490 nm下測定吸光度，按照（2）計算換算因子。

式中：F為換算因子；W為試樣的質(zhì)量，mg；C為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL；D為稀釋因子。

3.5 瑪咖多糖提取工藝的評價

試驗首先以料液比、提取溫度、提取時間為單因素，分別研究其對瑪咖多糖含量的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取溫度、料液比、時間進(jìn)行三因素三水平正交試驗以確定測定過程中所需瑪咖多糖提取的最佳條件。正交設(shè)計試驗因素水平如表2所示。

3.5.1 單因素試驗

3.5.1.1 料液比對多糖含量的影響

稱取1 g瑪咖干粉，按照料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），在70 ℃下，提取1 h，離心分離收集上清液，沉淀用熱水洗滌一次，離心收集上清液，合并兩次上清液，并定容至250 mL。移取0.5 mL此溶液定容至10 mL。從中取1 mL溶液于10 mL比色管中，并補充水分至2 mL，加入1 mL 6%的苯酚溶液，加入5 mL濃硫酸，煮沸15 min后冷卻，在490 nm測定吸光度。結(jié)合式（1）和（2）計算多糖含量。由圖3可知：瑪咖多糖含量先隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比增加到1∶30（g/mL）時，含量最大；隨后隨著料液比的增加，含量又逐漸減小。這種現(xiàn)象可歸為由于提取溶劑過少，提取不充分導(dǎo)致多糖含量較低；但溶劑過多將會使樣品濃度降低，不利于多糖提取，并且過多的溶劑會帶來后續(xù)溶劑回收成本過高的問題。因此，瑪咖多糖提取的最佳料液比應(yīng)控制在1∶30（g/mL）左右。

表2 正交設(shè)計試驗因素水平表

圖3 料液比對瑪咖多糖含量的影響

3.5.1.2 提取溫度對多糖含量的影響

稱取1 g瑪咖干粉，在40，50，60，70和80 ℃，料液比1∶30（g/mL）條件下，提取1 h。后續(xù)操作同3.5.1.1。瑪咖多糖的含量與溫度的關(guān)系如圖4所示?，斂Ф嗵呛侩S著溫度的升高，先上升后下降，在50 ℃時達(dá)到最大。這是因為溫度越高，多糖越容易進(jìn)入水相從而使瑪咖多糖的含量升高；當(dāng)溫度超過某一值后，不但會引起多糖與其他物質(zhì)之間的有機反應(yīng)，還會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，使多糖含量下降。故測定瑪咖多糖含量時，提取瑪咖多糖的最佳溫度為50 ℃。這一結(jié)論與王金全[26]通過水提法優(yōu)化瑪咖多糖工藝試驗中采用的溫度一致。

3.5.1.3 提取時間對多糖含量的影響

稱取1 g瑪咖干粉，料液比1∶30（g/mL），在50 ℃分別提取0.5，1，1.5，2和2.5 h。其余操作按3.5.1.1項進(jìn)行，計算多糖的含量。如圖5所示：瑪咖多糖含量會隨著提取時間的延長先增加后減小，當(dāng)時間延長到1 h時，含量最大。這是因為在一定的料液比和提取時間下，體系會達(dá)到提取平衡，含量將會在平衡值附近波動，而不再增加。因此，測定瑪咖多糖含量時，瑪咖多糖提取的最佳時間為1 h。

圖4 溫度對瑪咖多糖含量的影響

圖5 時間對瑪咖多糖含量的影響

3.5.2 正交設(shè)計試驗

正交設(shè)計試驗及極差分析如表3所示。對瑪咖多糖含量影響最大的因素是溫度，時間次之，最小的是料液比，即影響程度依次為提取溫度（A）＞提取時間（C）＞料液比（B）。測定瑪咖多糖含量時，提取瑪咖多糖的最佳工藝條件組合為A2B3C2，也就是溫度50 ℃，料液比為1∶40（g/mL），提取時間1 h。

表3 正交設(shè)計試驗結(jié)果

稱取1 g的瑪咖干粉，在50 ℃、料液比1∶40（g/mL）的條件下浸提1 h，后續(xù)操作同3.5.1.1。此時，測得瑪咖多糖含量為18.97%，高于表中最大含量。在此條件下得到的瑪咖多糖的含量與徐娟等[27]利用超聲輔助法在最佳工藝下提取黑瑪咖多糖的含量9.03%相比，有顯著的提高。故該方法可認(rèn)為是提取瑪咖多糖的有效方法。

3.6 穩(wěn)定性試驗

稱取1 g瑪咖干粉，在最佳條件下提取、離心分離收集上清液，沉淀用熱水洗滌，離心收集上清液，合并兩次上清液，并定容至250 mL。吸取1 mL于10 mL比色管中，補充水分至2 mL，加入1 mL 6%的苯酚，迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，冷水中冷卻。以蒸餾水為空白對照，分別于0，2，6，18和24 h在490 nm測量吸光度，結(jié)果見表4。在24 h內(nèi)，試驗樣品溶液的吸光度無明顯變化，δRSD為2.53%，說明采用該法得到的瑪咖多糖具有良好的穩(wěn)定性。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n=3）

3.7 加標(biāo)回收試驗

稱取1 g瑪咖粉末，操作同3.6。分別精密吸取1.00 mL此溶液于4支10 mL比色管中，一支加入1 mL蒸餾水，其余3支分別加入100 μL 0.10，0.050和0.025 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并補充水分至2 mL后，按3.6項方法操作，平行試驗3次，按照式（3）計算加標(biāo)回收率。

如表5所示，該方法回收率在104.00%～118.60%之間，平均回收率為109.67%，δRSD為7.14%，說明該測定方法準(zhǔn)確率高，可用于瑪咖中多糖含量的測定。

表5 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果（n=3）

4 結(jié)論

試驗用苯酚?硫酸法測定瑪咖多糖的含量。采用水提法，以料液比、提取溫度、提取時間為單因素，分別研究其對瑪咖多糖含量的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平正交設(shè)計試驗進(jìn)一步得到了測定瑪咖多糖含量時提取的最佳條件。結(jié)果表明：這3個因素對瑪咖多糖含量影響大小為溫度（A）＞時間（C）＞料液比（B）；料液比1∶40（g/mL），在50 ℃提取1 h，瑪咖多糖的含量最高，可達(dá)18.97%。試驗證明：所用的紫外-可見分光光度計精密度良好，該法得到的瑪咖多糖的穩(wěn)定性好，回收結(jié)果也令人滿意。鑒于水提取瑪咖多糖具有多糖含量高、省時、技術(shù)簡單等優(yōu)點，因此認(rèn)為這種方法也可以作為提取瑪咖多糖的有效方法。