姜宏宇，仇宏圖，曲可欣，馬明月，陳巍元，張華

1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食品與生物科學(xué)系（延吉 133002）；2.延邊大學(xué)東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心（延吉 133002）

藍(lán)莓（blueberry），又名越橘、藍(lán)漿果，果實(shí)為近圓形、呈藍(lán)色的小漿果。藍(lán)莓果實(shí)中營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，除了含有常見的糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等一般性營養(yǎng)成分外，還含有白藜蘆醇、多酚等具有生理功能的化學(xué)成分[1]。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種具有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，一般認(rèn)為是植物在遭受惡劣環(huán)境所產(chǎn)生的防御物質(zhì)[2]。有研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤、保護(hù)心血管、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[3-4]。

目前，國內(nèi)外白藜蘆醇大多都從葡萄、虎杖等植物中提取，王慧竹等[5]優(yōu)化了虎杖莖中白藜蘆醇提取工藝，得到最佳提取條件，即60%的乙醇在80 ℃下，按料液比1∶15 g/mL，提取2 h。該方法不僅溶劑用量大，耗時(shí)長，而且提取率不高，雜質(zhì)多。常永芳等[6]選用80%乙醇和80%丙酮的混合液為提取劑，得到虎杖中白藜蘆醇的最佳提取條件為V（80%乙醇）∶V（80%丙酮）=1∶3為提取液、料液比1∶6 g/mL、在70 ℃下超聲5 min，此時(shí)白藜蘆醇的提取率為2.612%。潘潤天等[7]優(yōu)化了花生紅衣中白藜蘆醇提取工藝，最佳工藝條件為取液料比值為15 mL/g，制提取時(shí)間為64 min，提取溫度為50 ℃，白藜蘆醇的含量為18.1785 μg/g。

而在藍(lán)莓中提取白藜蘆醇的有關(guān)研究較少。同時(shí)，國內(nèi)外藍(lán)莓中活性物質(zhì)的提取方法廣泛采用有機(jī)溶劑萃取法[8]，但僅靠溶劑浸提的方法，提取率并不高，添加果膠酶和纖維素酶，不僅加速植物體細(xì)胞壁的軟化，還有使其膨脹及崩潰的作用，促進(jìn)活性物質(zhì)的溶出，從而提高得率。因此，試驗(yàn)以藍(lán)莓為原料，采用復(fù)合酶輔助溶劑提取法有效提高藍(lán)莓中白藜蘆醇的提取量，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出影響含量的關(guān)鍵因素，再通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以期為優(yōu)化藍(lán)莓中白藜蘆醇的提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山地區(qū)新鮮藍(lán)莓；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品、纖維素酶、果膠酶，均購置阿拉丁試劑有限公司；甲醇、乙醇、氯化鉀、醋酸鈉、無水碳酸鈉等試劑均為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDZ5-MS型低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SPF-110X12型往復(fù)式恒溫震蕩水浴培養(yǎng)搖床，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FD-1C-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；DCY-SY12型恒溫水浴氮吹儀，浙江碩丹科技有限公司；JA1003J型分析天平，上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 藍(lán)莓粉的制備

新鮮藍(lán)莓榨汁后將藍(lán)莓果皮在冷凍干燥盤中均勻薄層鋪開封膜，放進(jìn)-80 ℃冰箱內(nèi)冷凍24 h拿出放入冷凍干燥機(jī)中，冷凍48 h取出刮粉得到初制樣品，將樣品放置研缽中磨碎（過孔徑0.150 mm篩）得樣品備用。

1.4 樣品溶液的制備

精密稱定藍(lán)莓果皮粉末0.5 g，按料液比1∶20 g/mL添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)酶解溫度和酶解pH，添加適量纖維素酶與果膠酶共1.5 mg，恒溫?fù)u床一段時(shí)間，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，分離出上清液。

1.5 樣品中白藜蘆醇含量的測(cè)定

參照師守國等[9]的方法，取50 μL待測(cè)樣品，采用與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定相同方法測(cè)定吸光度。白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇作為溶劑進(jìn)行定容。分別吸取溶液0，50，100，150，200，250和300 μL各置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到質(zhì)量濃度分別為0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 μg/mL的對(duì)照品溶液，以甲醇作為空白，分別測(cè)定在305 nm波長下的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 單因素試驗(yàn)

1.6.1 復(fù)合酶比例的確定

取7份0.5 g藍(lán)莓粉末樣品，選擇酶解溫度為50 ℃、酶解pH為5，酶解3 h，分按表1添加復(fù)合酶（同時(shí)使用單一纖維素酶和果膠酶作為對(duì)照），酶解反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定白藜蘆醇的含量。

1.6.2 酶解溫度的確定

取5份0.5 g藍(lán)莓粉樣品，選擇酶解pH為5、選擇上一組酶解最佳比例、酶解時(shí)間為3 h，控制酶解溫度分別為40，45，50，55和60 ℃，提取后測(cè)定白藜蘆醇的含量。

表1 復(fù)合酶比例對(duì)含量的影響 單位：g

1.6.3 酶解時(shí)間的確定

取5份0.5 g藍(lán)莓粉樣品，選擇上一組酶解最佳溫度、酶解最佳比例、酶解pH為5.0，控制酶解時(shí)間分別為1，2，3，4和5 h，提取后測(cè)定白藜蘆醇的含量。

1.6.4 酶解pH的確定

取5份0.5 g藍(lán)莓粉樣品，選擇上一組酶解最佳時(shí)間、酶解最佳溫度以及酶解最佳比例，控制酶解pH分別為3，4，5，6和7，提取后測(cè)定白藜蘆醇的含量。

1.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以白藜蘆醇的含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析法進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。最后應(yīng)用Design-Expert對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行構(gòu)圖分析，并對(duì)最優(yōu)值進(jìn)行預(yù)估。

表2 因素水平表

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 24.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)的顯著性，顯著性水平選擇0.05，最后采用Design-Expert 8.0分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶用量的確定

由圖1可知，復(fù)合酶的效果要比單一酶好。在使用復(fù)合酶的樣品中，白藜蘆醇的含量總體上呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。隨著果膠酶比例的增加，細(xì)胞間的果膠質(zhì)分解速度加快，白藜蘆醇苷釋放得更多，含量逐步增加，在復(fù)合酶中，果膠酶起到主要作用。當(dāng)纖維素酶：果膠酶比例為1∶5時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最大，為363.74 mg/L。綜合考慮顯著性差異，選取m（纖維素酶）∶m（果膠酶）5∶1，1∶1，1∶5 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.2 酶解溫度的確定

如圖2可知，隨著溫度升高，白藜蘆醇的含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在50 ℃達(dá)到最大值，白藜蘆醇含量為332.01 mg/L；當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí)，白藜蘆醇的含量開始下降。這是因?yàn)檫m宜的溫度下，酶的活性隨著溫度的上升而提高，細(xì)胞分解速度不斷提高，白藜蘆醇苷釋放速度加快，含量不斷提高；而溫度過高（＞50 ℃時(shí)），一方面酶在高溫下部分失活，活性受到抑制，另一方面白藜蘆醇在高溫下易分解，導(dǎo)致含量降低。綜合考慮，選取45，50和55 ℃ 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

圖1 不同復(fù)合酶比例對(duì)白藜蘆醇含量的影響

圖2 不同酶解溫度對(duì)白藜蘆醇含量的影響

2.3 酶解pH的確定

如圖3可知，隨著pH的增加，白藜蘆醇的含量總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。pH在3到6時(shí)，隨著pH增大，白藜蘆醇的含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)pH等于6時(shí)，白藜蘆醇的含量達(dá)到最大值，為318.77 mg/L；當(dāng)pH＞6后，白藜蘆醇的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。pH對(duì)白藜蘆醇含量的影響主要原因在于pH對(duì)酶的影響。pH在3～6范圍內(nèi)時(shí)，酶的活性隨著pH增大而增強(qiáng)，細(xì)胞壁分解加快，白藜蘆醇含量逐漸上升；pH在6～7范圍內(nèi)，酶的活性受到抑制，細(xì)胞壁分解速度減慢，含量開始下降。綜合考慮，所以酶解pH選擇5，6，7 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.4 酶解時(shí)間的確定

如圖4所知，當(dāng)酶解1 h后，白藜蘆醇含量趨于最大值，為314.20 mg/L。當(dāng)酶解2 h時(shí)，白藜蘆醇得率趨于下降，在3 h后白藜蘆醇含量再次上升。酶解4 h后，白藜蘆醇含量趨于平緩后開始下降。這可能是由于反應(yīng)開始時(shí)，底物濃度大，復(fù)合酶可快速水解底物，白藜蘆醇含量隨著酶解時(shí)間的增加而快速提高，從而達(dá)到相對(duì)最佳提取條件。在2 h時(shí)，可能由于部分酶由于酶解環(huán)境突然變化而使得酶解反應(yīng)緩慢，而容器內(nèi)氧氣氧化白藜蘆醇，導(dǎo)致白藜蘆醇含量下降。在3 h時(shí)，可能酶解完全，所以在此處上升。在4～5 h，白藜蘆醇含量變化可能主要受到容器內(nèi)氧氣的影響，且隨著容器內(nèi)氧氣消耗，下降速度減緩，最終白藜蘆醇含量將趨于穩(wěn)定。為了節(jié)省時(shí)間，又因?yàn)槊附鈺r(shí)間是相對(duì)影響因素最小的條件，故酶解時(shí)間選擇1 h。

圖3 不同酶解pH對(duì)白藜蘆醇含量的影響

圖4 不同酶解時(shí)間對(duì)白藜蘆醇含量的影響

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓白藜蘆醇提取工藝

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過單因素試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以復(fù)合酶比例、酶解溫度、酶解pH 3個(gè)因子為自變量，分別用A、B、C表示，以白藜蘆醇的含量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)了3個(gè)因素、3個(gè)水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以隨機(jī)次序進(jìn)行，重復(fù)3次獲得的響應(yīng)值均值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

2.5.2 數(shù)據(jù)模型建立與回歸分析

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到白藜蘆醇含量對(duì)復(fù)合酶比例（A）、酶解溫度（B）、酶解pH（C）的回歸模型方程Y（mg/L）=342.06+23.12A+7.71B+2.40C+5.99AB+0.51AC+0.86BC+11.90A2-20.29B2-13.44C2，Y為白藜蘆醇含量的預(yù)測(cè)值。一次項(xiàng)系數(shù)值的大小可以反映因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，由回歸方程可得出提取藍(lán)莓中白藜蘆醇的主次影響因素順序?yàn)閺?fù)合酶比例＞酶解溫度＞酶解pH。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5.3 回歸模型的方差分析

從表4方差分析可以看出，該模型的p＜0.001 8＜ 0.01，表現(xiàn)為極顯著。失擬項(xiàng)的p=0.088 4＞0.05，表明無失擬因素存在，各因素的效應(yīng)關(guān)系為復(fù)合酶比例＞酶解溫度＞酶解pH。其校正決定系數(shù)R2（adj）=0.860 8＞0.80和變異系數(shù)（CV）為2.59%，說明此模型擬合度好，誤差小，可以用來分析和預(yù)測(cè)白藜蘆醇的含量。

表4 回歸模型方差分析

2.5.4 響應(yīng)面分析

各因素的相互關(guān)系以及相互作用程度，可以通過響應(yīng)面圖反映[10]。通過觀察響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度，可以更加直觀、清晰地觀察兩因素之間關(guān)系，當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形且坡度較平緩時(shí)，表示兩因素交互作用不顯著，呈橢圓形且坡度較陡時(shí)，表示兩因素交互作用影響顯著[11]。

從3D響應(yīng)面圖（圖5～圖7）可以看出，各個(gè)因素對(duì)白藜蘆醇提取率的影響程度。由圖5可知，酶比例曲面的變化程度比酶解溫度曲面變化更大，說明酶比例對(duì)白藜蘆醇提取率的影響更顯著；由圖7可知，酶解溫度曲面變化程度比pH曲面變化程度大，說明酶解溫度對(duì)提取率的影響較顯著，以上均與方差分析相符。圖7等高線為橢圓形狀，說明酶解溫度和pH之間交互作用顯著。

圖5 酶比例和酶解溫度交互作用

圖6 酶比例和pH的交互作用

圖7 酶解溫度與pH的交互作用

2.5.5 提取條件的優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件回歸方程對(duì)進(jìn)一步優(yōu)化，由以上結(jié)果分析得出最佳提取工藝條件為m（纖維素酶）∶m（果膠酶）=0.99∶1，酶解反應(yīng)溫度為54.69 ℃，酶解pH為5.45，酶解時(shí)間為1 h，提取白藜蘆醇質(zhì)量濃度為372.76 mg/L。同時(shí)結(jié)合實(shí)際條件，最佳工藝選取m（纖維素酶）∶m（果膠酶）=1∶1，酶解反應(yīng)溫度為55 ℃，酶解pH為5.5，酶解時(shí)間為1 h，在此條件下白藜蘆醇含量為371.79 mg/L，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.26%。采用響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓中白藜蘆醇提取工藝條件是合理可行的。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓中白藜蘆醇的提取工藝條件，得出最佳提取工藝條件：m（纖維素酶）∶m（果膠酶）=1∶1，酶解反應(yīng)溫度為55 ℃，酶解pH為5.5，酶解時(shí)間為1 h，在此條件下白藜蘆醇含量為371.79 mg/L。