凌空，張銘晧，高麗輝，馮曉文，谷瑞增，劉文穎*

1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心（北京 100015）；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（北京 100083）；3.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院（北京 102206）

小麥谷朊粉又稱小麥蛋白粉或者小麥面筋粉，是小麥淀粉生產(chǎn)中的副產(chǎn)品，通過(guò)除去小麥面團(tuán)中的淀粉，再經(jīng)過(guò)烘干處理所制成的蛋白復(fù)合物[1]。小麥谷朊粉的蛋白質(zhì)含量在70%以上，作為植物源蛋白質(zhì)，含有大量人體必需氨基酸、礦物質(zhì)、硫胺素、核黃素、煙酸、維生素A及維生素C等[2-3]。

小麥低聚肽是以小麥谷朊粉為原料，經(jīng)調(diào)漿、定向酶解、特定的小肽分離、過(guò)濾、噴霧干燥等工藝獲得的小分子多肽類混合物，主要成分是由2～6個(gè)氨基酸分子構(gòu)成的小肽，分子質(zhì)量低于1 000 Da。小麥低聚肽具有水溶性好、分散穩(wěn)定、易吸收、生物活性強(qiáng)等特點(diǎn)。小麥低聚肽中氨基酸含量均衡，幾乎與小麥谷朊粉一樣，其中谷氨酸含量最高，大部分以谷氨酰胺的形式存在[4]。谷氨酰胺為人體內(nèi)含量最豐富的氨基酸，在人體中發(fā)揮重要的功效，對(duì)腸道屏障功能有顯著的保護(hù)作用。

機(jī)體在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列活性氧，正常情況下機(jī)體自身的防御體系可維持體內(nèi)氧化與抗氧化平衡，防止過(guò)氧化反應(yīng)。但是當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境毒物影響、自身發(fā)生衰老、處于精神緊張狀態(tài)、某些外源性藥物入侵時(shí)，此平衡會(huì)被打破，抗氧化體系發(fā)生紊亂，自由基代謝平衡失調(diào)，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而造成生物膜及大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，并且機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)與炎癥、免疫力降低、衰老、心血管疾病、糖尿病、癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-8]。外源性抗氧化物質(zhì)有助于維持體內(nèi)的氧化還原平衡，而小麥低聚肽以其良好的吸收特性及天然安全特性得到廣泛關(guān)注[9-10]。Zhu等[9]采用體外試驗(yàn)方法研究了小麥胚芽蛋白水解所得到的低聚肽的抗氧化活性，結(jié)果顯示，低聚肽的抗氧化活性接近于亞油酸乳液體系中的α-生育酚，且具有清除1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）自由基、過(guò)氧化物和羥自由基（·OH）的活性。目前，對(duì)小麥低聚肽抗氧化活性的研究多集中在體外抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。研究采用胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)小麥低聚肽進(jìn)行體外模擬消化，探討消化前后小麥低聚肽分子質(zhì)量的變化；通過(guò)評(píng)價(jià)DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、總抗氧化能力（ABTS法）和氧自由基吸收能力（ORAC值），進(jìn)一步研究小麥低聚肽消化前后抗氧化能力的變化，為相關(guān)功能性食品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥谷朊粉，安徽中弘生物工程有限公司；中性蛋白酶（≥1 600 AU/g）、堿性蛋白酶（≥400 000 DU/g），杜邦丹尼斯克公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Fluorescein（熒光指示劑）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、胃蛋白酶（≥250 units/mg），美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶（≥250 NFU/mg），美國(guó)Solarbio公司；乙腈（色譜純），美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；ABTS自由基清除能力檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；其他分析純?cè)噭本┗S。

HH-501型超級(jí)恒溫水浴鍋，常州國(guó)宇儀器制造有限公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京陸希科技有限公司；Spectra MR多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Dynex；LC-20A高效液相色譜儀，日本SHIMADZU公司；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司；SI-114型電子天平，美國(guó)Denver Instrument公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥低聚肽的制備

利用中性蛋白酶和堿性蛋白酶水解小麥谷朊粉。稱取400 g的谷朊粉，用蒸餾水溶解并定容至5 L，加入片堿或鹽酸調(diào)節(jié)pH，50 ℃下酶處理4 h，酶解結(jié)束后在100 ℃沸水浴條件下滅酶，冷卻至室溫后離心，經(jīng)陶瓷膜吸附和超濾膜過(guò)濾后，噴霧干燥備用[11-12]。工藝路線如下：

小麥谷朊粉→酶解→離心→小麥肽粗品→吸附→過(guò)濾→噴霧干燥→小麥低聚肽

1.2.2 小麥低聚肽體外模擬消化

體外模擬胃液消化實(shí)驗(yàn)：將5.0 g小麥低聚肽和0.2 g NaCl溶解于去離子水中，用1.0 mol/L的HCl調(diào)溶液pH至2.0，加入0.05 g胃蛋白酶于37 ℃水浴恒溫消化2 h，100 ℃沸水浴滅酶后冷卻至室溫，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，定容至100 mL。空白對(duì)照不加胃蛋白酶，其余處理流程相同[13-14]。

體外模擬腸液消化實(shí)驗(yàn)：將5.0 g小麥低聚肽和0.68 g KH2PO4溶解于去離子水中，用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.5，加熱至37 ℃后，加入0.05 g胰蛋白酶，37 ℃恒溫消化4 h后100 ℃沸水浴滅酶，冷卻至室溫，定容至100 mL。空白對(duì)照不加胰蛋白酶，其余處理流程相同[13-14]。

1.2.3 DPPH自由基清除率測(cè)定

將樣品用去離子水稀釋為1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，15.0和20.0 mg/mL 8個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度，分別與濃度為0.1 mmol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液等體積比例混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min，置于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度Ay；同時(shí)以不同濃度的樣品溶液與無(wú)水乙醇等體積混合，測(cè)得吸光度A1；用蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照，與同體積0.1 mmol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液混合，測(cè)得吸光度A2[15]。根據(jù)公式計(jì)算得到對(duì)DPPH自由基清除率：

1.2.4 ·OH清除率測(cè)定

參照Fenton反應(yīng)體系，對(duì)消化處理前后小麥低聚肽的·OH清除作用進(jìn)行對(duì)比。將樣品用去離子水稀釋為1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，15.0和20.0 mg/mL 8個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度。分別將不同濃度的樣品溶液與5 mmol/L FeSO4溶液、5 mmol/L水楊酸-無(wú)水乙醇溶液以1∶2∶2的體積均勻混合。試驗(yàn)組以1體積5.0 mmol/L H2O2溶液開(kāi)啟反應(yīng)；對(duì)照組以1體積蒸餾水開(kāi)啟反應(yīng)；空白對(duì)照組以蒸餾水代替樣品。37 ℃恒溫孵育1 h后于510 nm處測(cè)量吸光度，試驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組的吸光度分別記為Aw、A1、A2[16]。根據(jù)公式計(jì)算得到對(duì)·OH的清除率：

1.2.5 總抗氧化能力測(cè)定

將ABTS溶液與過(guò)硫酸鉀混合反應(yīng)形成墨綠色ABTS+工作液，靜置12 h，待工作液穩(wěn)定后備用。使用前用pH 7.4，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋35倍成為ABTS工作液，使其在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。向96孔板的每個(gè)孔中加入200 μL ABTS工作液，同時(shí)在標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔中加入10 μL不同濃度的Trolox（水溶性維生素E）標(biāo)準(zhǔn)溶液，在樣品檢測(cè)孔加入10 μL樣品溶液，緩緩混勻后室溫孵育6 min，于734 nm處測(cè)定吸光度。樣品的抗氧化能力以mmol/g Trolox表示[17]。

1.2.6 ORAC值測(cè)定

熒光96 孔板中加入25 μL樣品，25 μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)品（6.25，12.5，25，50，100，250，500 μmol/L）作為陽(yáng)性對(duì)照（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線），以及100 μL的Fluorescein（熒光指示劑，0.8 μmol/L），于37 ℃保溫20 min，然后加入75 μL，150 mmol/L偶氮類化合物AAPH，熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，每隔2 min測(cè)定1次，測(cè)定總長(zhǎng)時(shí)間為120 min，以pH 7.4，75 mmol/L的PBS為空白對(duì)照；另外做不加AAPH的對(duì)照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的ORAC值，結(jié)果表示為μmol/g Trolox[18-19]。

1.2.7 分子質(zhì)量分布測(cè)定

利用高效液相凝膠色譜法測(cè)定小麥低聚肽的分子質(zhì)量。色譜柱，TSKgel G2000 SWXL 300×7.8 mm；流動(dòng)相，V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=45∶55∶0.1；流速，0.5 mL/min；進(jìn)樣體積，10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)，220 nm；柱溫，30 ℃。樣品用流動(dòng)相配制為1.0 mg/mL的溶液，并利用孔徑0.2 μm聚四氟乙烯濾膜過(guò)濾，通過(guò)高效液相色譜儀進(jìn)行凝膠過(guò)濾，紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，最后通過(guò)GPC軟件處理色譜數(shù)據(jù)。同時(shí)配制4種0.1 g/100 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子質(zhì)量189 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子質(zhì)量451 Da）、桿菌酶（分子質(zhì)量1 450 Da）和細(xì)胞色素C（分子質(zhì)量12 500 Da），制作分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)利用Origin 8.5軟件（OriginLab Corp.，Northampton，MA，USA）處理。試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，每組數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥低聚肽消化前后的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除法是利用電子轉(zhuǎn)移和電荷中和的原理，是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)。DPPH自由基在有機(jī)環(huán)境中是一種穩(wěn)定的N離子自由基，在517 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收峰。當(dāng)DPPH自由基的單電子被體系中自由基清除劑中和后，其溶液顏色由紫色變?yōu)闇\黃或無(wú)色，直接表現(xiàn)為吸光度數(shù)值的下降。圖1顯示了經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化前后小麥低聚肽對(duì)DPPH自由基清除能力的變化。小麥低聚肽的DPPH自由基清除能力隨濃度的升高而加強(qiáng)。未經(jīng)處理的低聚肽清除能力稍強(qiáng)于消化后的低聚肽，IC50值分別為IC50胃蛋白酶處理=0.75 mg/mL，IC50胃蛋白酶對(duì)照=0.63 mg/mL，IC50胰蛋白酶處理=1.52 mg/mL，IC50胰蛋白酶對(duì)照=0.96 mg/mL。因此，小麥低聚肽模擬消化后的DPPH自由基清除活性略有下降，但仍可保持較高的水平。

圖1 不同處理的小麥低聚肽對(duì)DPPH自由基清除作用

2.2 小麥低聚肽消化前后的·OH清除能力

·OH是體內(nèi)最活潑的一種自由基，幾乎能與所有生物大分子發(fā)生反應(yīng)，氧化性極強(qiáng)，對(duì)人體危害性最高[20]。由圖2可知，小麥低聚肽的·OH清除能力隨濃度的升高而提升。經(jīng)消化酶處理后，其·OH清除能力與未處理的相比，僅有輕微下降。IC50分別為IC50胃蛋白酶處理=14.82 mg/mL，IC50胃蛋白酶對(duì)照=12.85 mg/mL，IC50胰蛋白酶處理=11.01 mg/mL，IC50胰蛋白酶對(duì)照=9.83 mg/mL，說(shuō)明小麥低聚肽對(duì)·OH清除能力具有較好的消化穩(wěn)定性。

圖2 不同處理的小麥低聚肽對(duì)·OH清除作用

2.3 小麥低聚肽消化前后的總抗氧化能力

通過(guò)ABTS自由基清除法評(píng)價(jià)小麥低聚肽消化前后的總抗氧化能力。此方法的原理是，以ABTS為顯色引發(fā)劑，當(dāng)加入氧化劑后，ABTS試劑在水溶液環(huán)境中可形成穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS自由基，在波長(zhǎng)734 nm處有最大吸收。當(dāng)加入抗氧化性物質(zhì)后ABTS自由基的電荷被中和，顏色變淺，吸光光度值隨之下降，下降趨勢(shì)可表明所檢測(cè)物質(zhì)抗氧化活性的強(qiáng)弱[21]。根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)品繪制的ABTS標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。經(jīng)計(jì)算，小麥低聚肽消化前后的總抗氧化能力見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，小麥低聚肽對(duì)ABTS自由基的清除能力略有下降，但沒(méi)有明顯變化。因此推測(cè)，小麥低聚肽在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下沒(méi)有發(fā)生大的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化。

圖3 ABTS標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 不同處理的小麥低聚肽的總抗氧化能力

2.4 小麥低聚肽消化前后的ORAC值

ORAC全稱為oxygen radical absorbance capacity，被譯為氧自由基清除能力或抗氧化能力指數(shù)，是目前抗氧化研究領(lǐng)域中為人們所關(guān)注的一個(gè)評(píng)價(jià)方法[22]。不同濃度Trolox的動(dòng)態(tài)熒光衰減曲線見(jiàn)圖4，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，y=0.842x+0.091 3，R2=0.998 3。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算最終小麥低聚肽消化前后的ORAC值，如表2所示。小麥低聚肽經(jīng)胰蛋白酶消化后，ORAC值略有提高，但沒(méi)有明顯變化；胃蛋白酶消化后，ORAC值降低了15.7%。推測(cè)經(jīng)胃蛋白酶處理后，小麥低聚肽不同肽段中部分抗氧化氨基酸殘基被消化而導(dǎo)致ORAC值降低。

圖4 不同濃度Trolox的動(dòng)態(tài)熒光衰減曲線

圖5 Trolox的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 不同消化方式下小麥低聚肽的ORAC值變化

2.5 小麥低聚肽消化前后的分子質(zhì)量分布

由表3可知，小麥低聚肽的分子質(zhì)量主要集中在150～1 000 Da，占總比例的70%以上，具有良好的水溶性、消化吸收性[23]。小麥低聚肽大多由2～10個(gè)氨基酸的短肽組成。胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，低聚肽的各區(qū)間分子質(zhì)量分布變化很小，重均分子質(zhì)量輕微減少，不超過(guò)0.3%。由此看出，小麥低聚肽具有較強(qiáng)的抗消化能力，小肽尤其是抗氧化性短肽基本不受蛋白酶作用的影響，這也進(jìn)一步解釋了小麥低聚肽消化后抗氧化活性得以保持的原因。

表3 不同處理的小麥低聚肽的分子質(zhì)量分布

3 結(jié)論

酶解制得的小麥低聚肽，分子質(zhì)量小于1 000 Da的部分占比在80%以上，有易吸收、溶解性好的特點(diǎn)。通過(guò)DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、總抗氧化能力和ORAC值測(cè)定試驗(yàn)，證明了酶法制備的小分子小麥低聚肽經(jīng)模擬胃腸道消化后仍有較好的抗氧化活性，與未消化處理的相比變化不大。胰蛋白酶消化較胃蛋白酶消化對(duì)小麥低聚肽的抗氧化活性影響更小，保證了它在吸收過(guò)程中仍具有較強(qiáng)的抗氧化活性。試驗(yàn)證實(shí)了小麥低聚肽具有較強(qiáng)的消化穩(wěn)定性和抗氧化活性，為其在天然功能性保健食品中的應(yīng)用提供了思路和理論支持。