丁蕾，何傳波，魏好程，吳國宏，上官宇晨，熊何健

集美大學食品與生物工程學院（廈門 361021）

西番蓮（Passiflora edulis）屬西番蓮科西番蓮屬，又叫百香果。西番蓮果氣味芳香、味道酸甜可口，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及花色苷、類胡蘿卜素、生物堿、生氰苷等活性成分[1]，有著廣闊的開發(fā)前景。西番蓮果皮花色苷的提取和應(yīng)用可有效促進西番蓮資源的綜合利用，產(chǎn)生較高的經(jīng)濟價值。

花色苷是花青素與糖分子以糖苷鍵結(jié)合的多酚類化合物。作為一種天然植物色素，在水果[2]、蔬菜[3]、谷物及其他作物中廣泛存在，并在不同酸堿度或金屬離子作用下呈現(xiàn)藍、紅和紫等不同顏色。植物界中存在的較為常見的花色苷是芍藥花素、天竺葵素、飛燕草素、矢車菊素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素6種花青素的糖苷[4]。相關(guān)研究表明，花色苷擁有抗炎[5]、抗氧化[6]、防御心血管疾病[7]、抗癌[8]、抗腫瘤[9]等生物活性，可應(yīng)用于預(yù)防糖尿病[10]、護腎[11]等食品的開發(fā)，在保健食品和化妝品領(lǐng)域有很大的開發(fā)潛力。

花色苷的提取工藝是其開發(fā)利用的關(guān)鍵步驟。超聲波輔助浸提、微波輔助法、酶法浸提法、超臨界流體萃取法、溶劑浸提法被廣泛應(yīng)用于植物活性成分的提取[12-14]。相比之下，溶劑浸提法工序簡單易操作，成本低，溶劑可回收，低殘留低，對環(huán)境無污染，更適合工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。

研究以西番蓮果皮為原料，采用檸檬酸酸化的乙醇溶液進行花色苷提取制備，通過單因素試驗探究乙醇體積分數(shù)、檸檬酸含量和料液比對西番蓮果皮中花色苷提取效果的影響；在單因素試驗的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面試驗優(yōu)化西番蓮果皮花色苷的浸提條件，為西番蓮果皮花色苷資源的開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西番蓮，市售，取外層果皮冷凍干燥粉碎，過80目篩后在-20 ℃凍存?zhèn)溆?；無水乙醇、一水合檸檬酸、氯化鉀、三水合乙酸鈉、鹽酸，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

Pilot3-6M真空冷凍干燥機（蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司）；EL104電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（金壇市國旺實驗儀器廠）；L550臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；UV-5200紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

1.2 pH示差法測定花色苷提取量

參考米聰[15]的方法，將待測樣品溶液分別與pH 1.0、pH 4.5緩沖溶液以1∶9的比例混勻，避光靜置15 min，用蒸餾水調(diào)零，并在最大可見吸收波長512 nm和700 nm處分別測定其吸光度并記錄。根據(jù)式（1）和（2）計算花色苷提取量。

式中：C為花色苷質(zhì)量濃度，mg/L；MW為花色苷摩爾質(zhì)量；DF為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾消光系數(shù)；m為花色苷含量，mg/g DW，DW為樣品干狀態(tài)；V為花色苷溶液的體積，mL；m0為樣品的干質(zhì)量，g。

1.3 單因素試驗

稱取0.500 0 g西番蓮果皮凍干粉末，在25 ℃下以酸化乙醇浸提2 h。分別考察不同乙醇體積分數(shù)（0，20%，40%，60%，80%和95%）、檸檬酸含量（0，0.1%，0.5%，1%，2%，4%和6%）、料液比（1∶15，1∶18，1∶21，1∶24，1∶27和1∶30 g/mL）對花色苷提取效果的影響。

浸提完成后于4 500 r/min離心30 min，取上清液定容至100 mL。取1 mL定容后的溶液，分別加入9 mL pH 1.0和pH 4.5緩沖液稀釋，混勻后靜置15 min，用蒸餾水調(diào)零，在512 nm和700 nm處測定其吸光度，計算其花色苷提取量，試驗平行3次。

1.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，將乙醇體積分數(shù)、檸檬酸含量、料液比3個因素作為自變量，西番蓮果皮中花色苷提取量作為響應(yīng)值，使用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，優(yōu)化西番蓮果皮花色苷提取工藝，如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表

1.5 驗證試驗

依照響應(yīng)面試驗得出的最佳提取條件進行浸提，試驗重復(fù)3次，計算花色苷提取量的平均值、預(yù)測值、標準偏差和相對標準偏差。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗均重復(fù)3次，結(jié)果采用“平均值±標準偏差”表示；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件處理；響應(yīng)面試驗采用Design-Expert 8.0.6.1軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分數(shù)對花色苷提取效果的影響

由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)為0～80%時，隨著體積分數(shù)的增加，花色苷提取量也逐漸增加；當乙醇體積分數(shù)超過80%時，花色苷提取量反而降低，這是由于乙醇體積分數(shù)增大導致溶液極性變小，使得極性的花色苷不易溶出，從而降低了花色苷的提取率[16]。因此，采用80%乙醇進行后續(xù)試驗。

圖1 乙醇體積分數(shù)對花色苷提取量的影響

2.2 檸檬酸含量對花色苷提取效果的影響

由圖2可知，隨著檸檬酸含量的增加，花色苷提取量也逐漸增加，當檸檬酸含量超過2%時，花色苷提取量反而下降。這可能是因為檸檬酸含量過多，使得溶液的酸性太強，導致花色苷的糖苷鍵水解，從而減少了花色苷的溶出[17]。因此，采用2%檸檬酸進行后續(xù)試驗。

圖2 檸檬酸含量對花色苷提取量的影響

2.3 料液比對花色苷提取效果的影響

由圖3可知，花色苷提取量隨著料液比的變化不斷增加，直至料液比達到1∶24（g/mL）時，花色苷提取量達到6.855 mg/g。后續(xù)花色苷提取量沒有明顯提高，這是因為當料液比為1∶24（g/mL）時，西番蓮果皮中的花色苷大部分已經(jīng)溶出。考慮到溶劑的持續(xù)增加不僅浪費提取溶劑，還會增加后續(xù)濃縮的難度[17]，因此采用料液比1∶24（g/mL）進行后續(xù)試驗。

圖3 料液比對花色苷提取量的影響

2.4 西番蓮果皮花色苷提取條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

基于上述單因素試驗的結(jié)果，選擇對西番蓮果皮花色苷提取量影響顯著的乙醇體積分數(shù)、檸檬酸含量、料液比3個因素為自變量，花色苷提取量為響應(yīng)值。利用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，設(shè)計三水平三因素，得出15組響應(yīng)面試驗，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

2.4.2 數(shù)據(jù)模型建立及回歸分析

應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件對響應(yīng)面試驗所得數(shù)據(jù)進行回歸分析及方差分析。二次多項回歸方程：Y=-64.522 64+1.376 54A-0.133 13B+1.673 52C+9.091 62×10-3AB+8.967 92×10-4AC+0.030 615BC-9.536 92×10-3A2-0.297 80B2-0.035 717C2。

由表3可知：該模型的F值為2 901.67，p＜0.000 1，表明對西番蓮果皮花色苷提取建立的回歸模型是極顯著的。模型的擬合度R2=0.999 8，說明該模型能夠較好地描述試驗結(jié)果，試驗誤差小，有較高的可信度。

表3 回歸模型方差分析表

在該模型中，A、C、A2、B2、C2表現(xiàn)極顯著，B、AB、BC表現(xiàn)顯著，而AC表現(xiàn)不顯著，由此可見乙醇體積分數(shù)、檸檬酸含量和料液比對西番蓮果皮花色苷的提取量均有顯著影響。將方差分析中各因素的F值大小作為各因素影響花色苷提取量的依據(jù)，可得三個因素影響程度排序：乙醇體積分數(shù)（A）＞料液比（C）＞檸檬酸含量（B）。

失擬項p=0.705＞0.05，說明失擬項與純誤差之間不存在顯著性差異，無失擬因素的存在。校正擬合度（R2Adj=0.999 5）和預(yù)測擬合度（R2Pred=0.998 4）相差小，預(yù)測值與實際值的相關(guān)性高，試驗誤差小。變異系數(shù)（C.V.）為0.66%，較小，進一步說明該模型能更準確、更可靠地反映各因素與花色苷提取量之間的關(guān)系。因此，該模型能夠用于對西番蓮果皮花色苷提取量的分析和預(yù)測。

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

由Design Expert 8.0.6.1軟件繪制等高線圖和響應(yīng)圖，分析乙醇體積分數(shù)、檸檬酸含量和料液比對西番蓮果皮花色苷提取量的交互影響。響應(yīng)面坡面越陡峭表明花色苷提取量受試驗因素變化就越大，響應(yīng)面坡面越平緩表明花色苷提取量受試驗因素變化就越??；而越圓的等高線則說明兩因素之間的交互作用不顯著，若為橢圓形狀，交互作用明顯[18]。

由圖4可知，乙醇體積分數(shù)和檸檬酸含量有顯著的交互作用，乙醇體積分數(shù)對花色苷提取量的影響比檸檬酸含量明顯；由圖5可知，乙醇體積分數(shù)和料液比的交互作用顯著，乙醇體積分數(shù)對花色苷提取量的影響大于料液比；由圖6可知，料液比和檸檬酸含量的交互作用不顯著。綜上可知，乙醇體積分數(shù)對西番蓮果皮花色苷提取量的影響最顯著，花色苷提取量隨著乙醇體積分數(shù)的升高而下降，呈現(xiàn)陡峭的曲面。

圖4 乙醇體積分數(shù)和檸檬酸含量對西番蓮果皮花色苷提取量的交互影響

圖5 乙醇體積分數(shù)和料液比對西番蓮果皮花色苷提取量的交互影響

圖6 檸檬酸含量和料液比對西番蓮果皮花色苷提取量的交互影響

2.4.4 最佳提取條件的確定與驗證

由響應(yīng)面優(yōu)化試驗確定的西番蓮果皮花色苷最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)74.41%、檸檬酸含量2.21%、料液比為1∶25.3（g/mL），花色苷的理論提取量為7.726 mg/g。為了檢驗實際操作的可行性，在驗證試驗中將提取工藝修訂為乙醇體積分數(shù)75%、檸檬酸含量2.21%，料液比1∶25（g/mL），驗證試驗值為7.681 mg/g，與數(shù)學模型優(yōu)化得到的理論值相近，且標準偏差為0.033 4，相對標準偏差為0.004 3，說明擬合良好、參數(shù)可靠，該模型在優(yōu)化西番蓮果皮花色苷提取工藝上是合理可行的。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化西番蓮果皮花色苷的提取工藝參數(shù)，建立二次回歸模型，該模型與實際情況擬合度較好，能準確反映花色苷提取量與乙醇體積分數(shù)、檸檬酸含量、料液比之間的關(guān)系。其中影響花色苷提取量的最大因素是乙醇體積分數(shù)，其次是料液比和檸檬酸含量。通過響應(yīng)面分析優(yōu)化，最終確定西番蓮果皮花色苷最佳提取工藝條件：乙醇體積分數(shù)75%、檸檬酸含量2.21%、料液比1∶25（g/mL），在此條件下的花色苷提取量為7.681 mg/g，驗證結(jié)果接近預(yù)測值7.726 mg/g，說明優(yōu)化提取工藝準確可靠。