王靜，冉志玲，杜淵，王新雪

（1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

0 引言

腹瀉病是我國兒科關(guān)注的重點，是五歲以下兒童死亡的常見原因之一。急性腹瀉在兒童腹瀉病診斷治療指南推出以后診療得到了規(guī)范，治療水平得到極大提高，急性腹瀉的死亡率已大大降低[1]，而慢性腹瀉病程長，病因復(fù)雜、治療方式局限，療效欠佳，常伴有營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙，并導(dǎo)致營養(yǎng)不良、生長發(fā)育障礙、免疫功能低下及反復(fù)感染等，嚴(yán)重影響兒童體格與智力發(fā)育，因此我們建議應(yīng)該加強(qiáng)對慢性腹瀉的研究。從中醫(yī)來講，慢性腹瀉屬于中醫(yī)“久泄”范疇，脾虛是該病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是腹瀉遷延不愈，反復(fù)發(fā)作的主要因素。我院兒科基于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“甘生脾”理論，臨床上運用小建中湯治療小兒脾虛泄瀉療效好。為探索小建中湯是否能通過提高腸道局部粘膜免疫功能從而達(dá)到治療脾虛泄瀉的目的，本研究通過觀察幼鼠的一般情況、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)，同時采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測腸粘膜分泌型免疫球蛋白（SlgA）、IL-2、IL-4的水平變化，以期為小建中湯治療脾虛泄瀉提供可能的實驗依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下：

1 實驗方案

1.1 動物

昆明幼年雄性小鼠48只，體重20.55±1.13g，動物由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（SCXK（川）2018-17）。

1.2 藥物及試劑

中藥煎液：采用目前較為公認(rèn)的柯氏觀點（根據(jù)漢代出土文物中衡器與量器換算的結(jié)論）[2]，東漢1升≈ 200毫升（今），1兩≈15.62g（今）計算東漢時期小建中湯原方劑量約為：飴糖 150g（生產(chǎn)許可證號 SC11332040400877）、桂枝 45g、芍藥90g、生姜45g、大棗45g、炙甘草30g,根據(jù)人與動物劑量折算表[3]換算出相應(yīng)的幼鼠用藥劑量，將其制成生藥濃度約2.63g/mL 的濃縮液150mL，設(shè)定為小建中湯高劑量；小建中湯現(xiàn)代方劑學(xué)教材推薦劑量參考第九版方劑學(xué)教材[4]為飴糖 30g、桂枝 9g、芍藥 18g、炙甘草 6g、生姜 9g、大棗 9g、制成生藥濃度為0.52g/mL的水煎液150mL，設(shè)定為小建中湯低劑量；生大黃水煎液: 大黃300g，制成生藥濃度為1g/mL藥液300mL。上述中藥水煎液完成后均保存于4℃冰箱。以上藥材（除飴糖外）由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，中藥煎劑由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室協(xié)助完成。

試劑：小鼠分泌型免疫球蛋白A（SlgA）elisa試劑盒、小鼠白介素4（IL-4）、白介素2（IL-2）elisa試劑盒均購自睿信生物。

1.3 分組及造模

將48只幼鼠隨機(jī)分為2組，正常組（A組）12只，造模組36只，采用生大黃水煎液復(fù)制脾虛泄瀉幼鼠模型。每天給予A組幼鼠生理鹽水0.2mL/10g灌胃，每天一次。其余幼鼠均灌服生大黃水煎液0.2mL/10g，每天一次，連續(xù)7天造模。參考北京師范大學(xué)脾虛動物造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[5]及脾氣虛證模型診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，認(rèn)為本研究幼鼠出現(xiàn)大便不成型，食少納呆，體重增長減慢或減輕，神態(tài)萎靡，毛色無光澤、枯槁或疏散或豎立，蜷縮聚堆、抓取時掙扎無力癥狀，即可認(rèn)為脾虛泄瀉造模成功。于第8天將造模成功的幼鼠再隨機(jī)分為3組，脾虛泄瀉組（B組）、小建中湯高劑量組（C組）、小建中湯低劑量組（D組）。

1.4 給藥方法

第8天，對C組予以小建中湯高劑量（2.63g/mL）藥液灌胃治療，對D組進(jìn)行小建中湯低劑量（0.52g/mL）藥液灌胃治療，每只0.2mL/10g，每天一次，連續(xù)灌藥10d。A組和B組予生理鹽水灌胃，每只0.2mL/10g，每天一次，連續(xù)10d。

1.5 標(biāo)本采集

于第18天麻醉后（苯巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射）采用頸椎脫臼法處死各組幼鼠，取幽門下小腸組織20cm置于標(biāo)本凍存管內(nèi)，迅速放于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80°冰箱保存?zhèn)溆?，解剖后稱重幼鼠的胸腺和脾臟。

1.6 觀察指標(biāo)

（1）一般情況：觀察每日幼鼠的精神、飲食、皮毛光澤、運動、體重、大便性狀情況。

（2）胸腺指數(shù)：稱量幼鼠的體重和胸腺，計算胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體重(g)。

（3）脾指數(shù)：稱量幼鼠的體重和脾臟，計算脾指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)。

（4）腸粘膜組織slgA含量測定：取幽門下20cm小腸組織，平鋪于無菌培養(yǎng)皿中，縱向剪開，放入裝有8mLPBS溶液的離心管中，渦旋15s，3000rpm離心20min，收集上清液，按照幼鼠slgAelisa試劑盒嚴(yán)格進(jìn)行操作。

（5）腸粘膜組織IL-2、IL-4濃度測定：取上述小腸組織上清液，按照幼鼠白介素4（IL-4）、白介素2（IL-2）elisa試劑盒進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。先進(jìn)行正態(tài)檢驗及方差齊性檢驗，對兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，對多組間比較采用單因素方差分析，多樣本間的兩兩比較采用LSD-t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 造模后幼鼠的一般情況

實驗前正常組和造模組的幼鼠活躍、皮毛柔順整潔有光澤、飲食可、大便正常、抓取時掙扎有力，且實驗前兩組幼鼠體重比較無差異性（P=0.689＞0.05）。造模7d結(jié)束，第8天時造模組幼鼠的表現(xiàn)為大便不正常（不成型，肛門周圍皮毛污穢或稀軟便等），毛發(fā)豎立、疏散、少光澤、神態(tài)萎靡、瞇眼、食少、聚堆、灌胃抓取時掙扎無力等表現(xiàn)，且造模組的幼鼠體重較正常幼鼠顯著增長緩慢（P＜0.05）（由表1可知），提示造模成功。

表1 造模前后幼鼠的體重變化（±s）

表1 造模前后幼鼠的體重變化（±s）

注：數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，具有方差齊性，故采用獨立樣本T檢驗；P＜0.05,表明組間具有差異性

組別 造模前（g） 造模后（g）正常組（n=12） 20.667±1.285 26.242±2.341造模組（n=36） 20.514±1.089 21.919±2.126 T 0.402 5.950 P 0.689 0.000

2.2 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠一般情況及體重的影響

予以小建中湯干預(yù)后，脾虛泄瀉幼鼠逐漸精神好轉(zhuǎn)，飲食增加，皮毛光澤整潔，大便由不成型便到軟便、正常便，逐漸活躍好動，掙扎、有力，提示脾虛癥狀逐漸恢復(fù)。由表2可知，給藥前，正常組幼鼠的體重顯著高于其余三組造模成功的幼鼠（P＜0.05)，且B、C、D三組幼鼠給藥前的體重沒有差異性（P＞0.05）。經(jīng)予以小建中湯干預(yù)后，C、D組的幼鼠體重出現(xiàn)明顯增長，均顯著高于B組（脾虛泄瀉組）（P＜0.05），且與正常幼鼠的體重?zé)o差異性（P＞0.05）。表明，小建中湯有促進(jìn)脾虛泄瀉幼鼠體重增長的作用。

表2 小建中湯對幼鼠的體重影響（±s）

表2 小建中湯對幼鼠的體重影響（±s）

注：*，表示與A組進(jìn)行對比，P＜0.05；#，表示與B組比較，P＜0.05

組別 給藥前（g） 給藥后（g）A組(正常組) 26.242±2.341 28.975±1.622#B組（脾虛泄瀉組） 21.825±2.362* 25.892±3.290*C組（小建中湯高劑量組） 22.017±2.412* 30.108±3.098#D組（小建中湯低劑量組） 21.917±1.723* 28.375±2.845#齊性檢驗 0.764(P=0.521) 2.110(P=0.113)F 11.314 4.894 P 0.000 0.005

2.3 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響

由表3可知，脾虛泄瀉幼鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)明顯低于正常組幼鼠（P＜0.05）。對脾虛泄瀉幼鼠予以小建中湯干預(yù)后，C、D兩組的胸腺指數(shù)較脾虛泄瀉組均了出現(xiàn)顯著性增長（P＜0.05）。C組的脾指數(shù)增長顯著，D組的脾指數(shù)增加無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。從數(shù)據(jù)結(jié)果來看，C和D組的胸腺和脾指數(shù)均高于B組（脾虛泄瀉組），同時接近于A組（正常組）。說明，小建中湯有提高脾虛泄瀉幼鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)水平的作用。

表3 小建中湯干預(yù)對幼鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（±s）

表3 小建中湯干預(yù)對幼鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（±s）

注：#,表示與B組進(jìn)行對比，P＜0.05

組別 脾指數(shù)（mg/g） 胸腺指數(shù)（mg/g）A組（正常組） 6.446±1.819# 2.299±0.601#B組（脾虛泄瀉組） 4.540 ±1.754 1.526±0.461 C組（小建中湯高劑量組） 6.191±1.688# 2.304±0.536#D組（小建中湯低劑量組） 5.718±1.686 2.008±0.401#齊性檢驗 0.069(P=0.976) 1.265(P=0.298)F 2.835 6.295 P 0.049 0.001

2.4 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠腸粘膜slgA的作用

由表4可知，脾虛泄瀉幼鼠腸粘膜分泌SlgA的水平較正常組幼鼠出現(xiàn)顯著性下降（P＜0.05）。經(jīng)予以小建中湯干預(yù)后，C組和D組幼鼠腸粘膜分泌的SlgA水平，較B組（脾虛泄瀉組）明顯升高（P＜0.05），且C組幼鼠分泌SlgA的水平高于D組（P＜0.05）。表明小建中湯可以促進(jìn)脾虛泄瀉幼鼠腸粘膜分泌SlgA，且小建中湯高劑量提高脾虛泄瀉幼鼠SlgA水平的作用優(yōu)于小建中湯低劑量組。

2.5 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠小腸粘膜組織IL-2、IL-4含量的影響

由表4可知，與正常幼鼠相比，脾虛泄瀉幼鼠小腸組織分泌的 IL-2水平下降（P＜0.05），而 IL-4水平升高（P＜0.05）；與脾虛泄瀉組比較，小建中湯干預(yù)后，C組和D組幼鼠的IL-2水平顯著性上升（P＜0.05），C組的IL-2水平高于D組,但不顯著（P=0.056）。而小建中湯干預(yù)后C、D組IL-4水平均有下降，但C組IL-4水平下降更顯著（P＜0.05），而D組IL-4水平降低無顯著意義（P＞0.05）。說明，小建中湯可以上調(diào)小腸粘膜組織中IL-2的水平，而降低IL-4的水平，且小建中湯高劑量組對IL-2、IL-4的調(diào)節(jié)作用更明顯。

表4 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠小腸粘膜SlgA、IL-2、IL-4的影響（±s）

表4 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠小腸粘膜SlgA、IL-2、IL-4的影響（±s）

注：表示與B組進(jìn)行對比，#，P＜0.05；表示D組進(jìn)行比較，※,P＜0.05

組別 slgA（μg/mL） IL-2（pg/mL） IL-4（pg/mL）A組（正常組） 24.463±2.315# 158.746±30.522# 130.938±16.594#B組（脾虛泄瀉組） 18.441±2.856 103.121±21.108 168.703±17.098 C組（小建中湯高劑量組） 27.570±2.658#※ 181.261±22.798# 153.185±17.656#D組（小建中湯低劑量） 25.423±2.520# 161.04±25.597# 162.066±11.699齊性檢驗 0.401(P=0.753) 1.010(P=0.397) 1.042(P=0.384)F 27.265 21.122 12.807 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

小兒素體脾弱，運化功能尚未臻全，加之后天調(diào)護(hù)失宜，罹患他病或久病遷延不愈，進(jìn)一步損傷脾胃，致脾弱不健運，胃虛不腐熟，水谷不化，精微不布，精華糟粕不分，合污而下，混走大腸，從而發(fā)生脾虛泄瀉。小兒脾虛泄瀉以病程長，遷延不愈為特點，精微不能輸化，氣血化生乏源，不足以濡養(yǎng)臟腑肌膚，易生疳證；久泄致土虛木旺，內(nèi)風(fēng)從生，可成慢驚風(fēng)；土虛不生金，皮膚毛竅不榮，腠理不密，正氣虧虛，易為外邪所害，故患兒容易反復(fù)感冒；脾虛泄瀉，所生疳證、慢驚風(fēng)、反復(fù)感冒與今慢性腹瀉易合并營養(yǎng)不良、反復(fù)呼吸道感染、驚厥具有高度的一致性，因此，脾虛是慢性腹瀉的主證，小兒脾虛泄瀉是兒科醫(yī)生們高度重視的疾病之一。

脾虛泄瀉者，脾不健運，水谷精微不化，氣血不充，形神失養(yǎng)，則神疲、倦怠、發(fā)力；脾胃升降失職，脾不升則精微物質(zhì)不能輸布，無以營養(yǎng)皮毛，則出現(xiàn)皮膚毛發(fā)枯燥、少華；胃不降則受納腐熟失常，不思飲食，則出現(xiàn)體重減輕、體重不增或增長減慢。脾虛致泄者，先損脾氣、再傷脾陽，不能發(fā)揮溫煦作用，則畏寒怯冷。本實驗結(jié)果顯示脾虛泄瀉造模后的幼鼠，出現(xiàn)大便溏泄、體重增長緩慢、食少，神態(tài)萎靡，毛色欠光澤、豎立，蜷縮聚堆、抓取時掙扎無力癥狀，符合脾虛泄瀉模型標(biāo)準(zhǔn)。

現(xiàn)代大量的研究證實脾虛泄瀉與人體免疫功能紊亂關(guān)系密切。胸腺是人體重要的中樞性免疫器管，通過分泌多種細(xì)胞因子和胸腺激素，促進(jìn)胸腺細(xì)胞（處于不同階段的T細(xì)胞）分化、發(fā)育、成熟，主要參與細(xì)胞免疫，輔助體液免疫，同時也是機(jī)體固有免疫（γδT細(xì)胞）的組成部分。脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器管，含有大量的B細(xì)胞、部分T細(xì)胞和少量巨噬細(xì)胞，主要參與體液免疫、細(xì)胞免疫，對非特異性免疫有輔助作用。器官的重量一定程度上可以反映免疫細(xì)胞的數(shù)量。本實驗結(jié)果顯示造模成功的脾虛泄瀉幼鼠胸腺及脾臟指數(shù)較正常幼鼠下降，可以初步提示脾虛泄瀉幼鼠免疫功能下降，但予以小建中湯藥液干預(yù)后，脾臟及胸腺指數(shù)均有上升，說明小建中湯對免疫功能有改善作用。

腸道局部免疫功能下降，被認(rèn)為是脾虛泄瀉遷延不愈的主要原因[7]。正常情況時 ,腸粘膜相關(guān)淋巴組織中含有大量的B細(xì)胞 ,其中 70 %至 90 %是分泌 IgA的[8]。分泌型IgA（SlgA）是腸粘膜的主要免疫球蛋白，可阻止細(xì)菌粘附定植于腸道粘膜表面，還可中和腸道內(nèi)病毒與病菌的毒素作用，同時可以與補體及溶酶體共同作用溶解細(xì)菌，是腸粘膜發(fā)揮抗感染免疫防御的關(guān)鍵因子，被稱為是腸粘膜免疫的核心[9]。有大量的實驗發(fā)現(xiàn)在脾虛泄瀉腸粘膜分泌SlgA的量會下降[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃致脾虛泄瀉幼鼠小腸粘膜分泌的SlgA含量較正常幼鼠減少，符合目前已有的研究結(jié)論。與脾虛泄瀉幼鼠相比，小建中湯可以上調(diào)腸粘膜對SlgA的分泌，東漢時期仲景原方劑量對SlgA產(chǎn)生的促進(jìn)作用優(yōu)于現(xiàn)代方劑學(xué)教材推薦的劑量。

輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞），是輔助T、B細(xì)胞參與免疫反應(yīng)的亞群。Th1和Th2細(xì)胞是相互調(diào)節(jié)、相互抑制的，二者的平衡失調(diào)與多種疾病的發(fā)生相關(guān)。IL-2、IL-4分別代表Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫。有實驗證實，脾虛泄瀉大鼠較正常大鼠相比血清IL-2下降，而IL-4升高[13]。相反，也有學(xué)者通過大黃苦寒瀉下法建立脾虛模型，發(fā)現(xiàn)脾虛小鼠血清IL-2、IL-4均較正常鼠下降[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)大黃致脾虛泄瀉幼鼠的腸粘膜組織中IL2、IL-4含量與正常幼鼠比較，IL-2下降，而IL-4上升，這可能與Th2細(xì)胞分泌的IL-4會抑制Th1細(xì)胞的分化和增值，從而使Th1細(xì)胞分泌IL-2減少有關(guān)。提示脾虛泄瀉時Th0（未完全分化的Th細(xì)胞）向Th2分化增多，破壞Th1和Th2的平衡關(guān)系。經(jīng)小建中湯干預(yù)后，脾虛泄瀉幼鼠小腸粘膜組織分泌的IL-2水平升高，而IL-4的水平會下降。說明小建中湯可以通過促使脾虛泄瀉幼鼠的小腸粘膜組織分泌IL-2而抑制IL-4的產(chǎn)生，使脾虛泄瀉狀態(tài)Th0分化Th1細(xì)胞占優(yōu)勢，重新調(diào)節(jié)Th1和Th2的比例來改善腸道免疫功能，改善脾虛癥候的作用。同時東漢時期仲景小建中湯原方劑量和現(xiàn)代方劑學(xué)推薦劑量相比，仲景原方劑量對脾虛泄瀉Th1和Th2的這種調(diào)節(jié)作用要優(yōu)于現(xiàn)代教材推薦的劑量。

小建中湯可以改善腸道局部粘膜免疫功能，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為小建中湯關(guān)鍵的作用在于甘溫補脾建中。久瀉、虛瀉者，先損脾氣，繼損脾陽，脾氣虧虛，水濕不化，困阻脾陽，脾陽不振，中陽不舉，則泄瀉遷延難愈。治療要點，重在補益脾氣，使脾運復(fù)健，脾陽振奮，則水濕得以溫化。根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載“土生甘，甘生脾”“五味入胃，.甘先入脾..”，認(rèn)為甘味生于谷,谷是土之所生,甘為土之味也，味甘者，最能補人以脾氣，故臨床上我們采用甘味湯劑小建中湯治療脾虛泄瀉能獲得滿意效果。小建中湯為甘溫補脾建中的代表方劑，方中重用甘溫質(zhì)潤者，膠飴（又名飴糖）為君，以甘潤建土，《本草綱目》稱其為“補虛冷，益氣力..健脾胃，補中”。桂枝味辛、甘，性溫，走而不守，《本草綱目》日：“桂枝透達(dá)營衛(wèi)，脾主營，肺主衛(wèi)，甘走脾，辛走肺也”，桂枝合甘潤膠飴配伍，可入脾經(jīng)，溫通脾陽，振奮中氣，復(fù)脾運之職，同時防飴糖滋膩之性礙脾。芍藥，味苦，酸，性微寒?！夺t(yī)學(xué)啟源》稱其可安脾經(jīng)，收胃氣，止瀉痢，和血脈，固腠理。合君藥以酸甘化陰，以復(fù)失之津，且有斂氣止瀉、柔肝扶土之功。生姜、大棗、草可助君藥補脾健胃，化生氣血，充養(yǎng)五臟六腑。諸藥相配伍，有溫中健脾止瀉之力，同時有燮理陰陽、補益氣血、固實腠理、柔肝緩急之功，可治脾虛泄瀉繼發(fā)疳證、慢驚風(fēng)、反復(fù)感冒等，故謂之乃脾虛泄瀉之妙方也。本方以建立中氣為本，中氣立，脾胃復(fù)其升降，脾健運且升清，而胃腐熟且通降，可以改善脾虛本質(zhì)，從而可以提高脾虛泄瀉幼鼠的腸道粘膜免疫功能的作用。

綜上，小建中湯可以上調(diào)脾虛泄瀉幼鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、小腸粘膜組織的slgA、IL-2，下調(diào)IL-4水平，來調(diào)節(jié)腸道粘膜免疫功能，改善脾虛本質(zhì)，這可能是治療脾虛泄瀉的機(jī)制之一，且仲景原方劑量對改善腸粘膜免疫功能的作用優(yōu)于現(xiàn)代方劑學(xué)教材推薦劑量。小建中湯治療脾虛泄瀉值得推廣，且經(jīng)方配伍及劑量應(yīng)該得廣泛的重視。