王 晨，馬欣欣，平琳琳，王 謙

（河北大學(xué) 生命科學(xué)院，河北 保定 071000）

當(dāng)前食（藥）用真菌與發(fā)酵工業(yè)的交叉，成為食用菌行業(yè)進(jìn)步的標(biāo)志之一。液體菌種具有培養(yǎng)周期短、不受季節(jié)限制、利于規(guī)?；?、接種方便、菌絲體生長一致等優(yōu)勢[1-2]，液體培養(yǎng)的方式能夠有效提高菌類產(chǎn)量和效益，而且在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的黑木耳產(chǎn)業(yè)，液體菌種的應(yīng)用已經(jīng)成為產(chǎn)業(yè)常態(tài)。與此同時，對于其液體發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物如黃酮、多酚、多糖等[3-6]的應(yīng)用也愈發(fā)受到重視，良種選育已經(jīng)成為發(fā)酵工業(yè)重要的應(yīng)用基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。黑木耳（Auricularia auriculae）作為我國食用菌產(chǎn)量排名第二的菌類，不僅口味鮮美而且營養(yǎng)豐富，還具有抗癌、降血脂、提高免疫力等作用[7]。目前食（藥）用菌一般采用孢子分離、雜交育種、紫外誘變等育種方法，近年來出現(xiàn)的ARTP誘變技術(shù)育種[8]，在黑木耳育種研究中尚無報道。本試驗探究了ARTP育種技術(shù)在選育發(fā)酵性狀優(yōu)良的黑木耳細(xì)胞工程菌株方向的應(yīng)用，并對其在發(fā)酵、液體菌種應(yīng)用、多糖含量等方面開展了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

供試菌株：出發(fā)菌株為黑木耳黑威半筋品種，黑龍江微生物研究所提供；細(xì)胞工程菌株：Aa66、Aa98、Aa101、Aa285。以上菌株均保存于河北大學(xué)食藥用真菌研究所。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 20.0%、葡萄糖2.0%、麩皮 2.0%、瓊脂 2.0%、KH2PO40.1%、Mg－SO40.1%，pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%、玉米粉0.5%、豆粕粉0.5%、MgSO40.1%、酵母膏0.2%、KH2PO40.2%，pH自然。

1.2 ARTP誘變育種技術(shù)選育黑木耳細(xì)胞工程菌株

1.2.1 菌絲體的制備

按液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行配制，500 mL三角瓶中裝液量200 mL，通過無菌操作對活化后的PDA斜面黑木耳菌種進(jìn)行接種[9]，并于28℃、160 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)5 d[10]，獲得黑木耳菌絲體。

1.2.2 菌懸液的制備

在超凈工作臺上，將制備好的黑木耳菌絲體發(fā)酵液經(jīng)80目銅絲網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)移液槍取10 mL至離心管中，8 000 r·min-1離心5 min后棄上清，無菌水沖洗沉淀2次，再次離心后加入無菌水，搖勻后得菌懸液[11]。

1.2.3 ARTP誘變處理

在超凈工作臺中，用移液槍吸取10 μL菌懸液懸浮于載片上，并放入ARTP誘變儀操作倉中，將各參數(shù)分別設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下氣流量10 L·min-1、輸出功率100 W、輻射距離2 mm[12]，誘變時間梯度為 0、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s、35 s、40 s、45 s、50 s，在每個時間點設(shè)置3個平行樣品，0為對照組。將經(jīng)過誘變處理后的載片夾放于裝有1 mL無菌水的EP管中，置于渦旋振蕩器上混合均勻，再用移液槍吸取300 μL液體涂布于再生培養(yǎng)基平板，封口膜密封后恒溫避光培養(yǎng)5 d～7 d，記錄再生菌株數(shù)，得到致死率曲線，并確定最佳誘變照射時間。

重復(fù)試驗，獲得大量黑木耳誘變菌株后，挑取再生培養(yǎng)基中長勢較好的菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，并進(jìn)行標(biāo)號記錄。

1.2.4 再生菌株的篩選

將經(jīng)ARTP誘變所獲得的再生菌株以出發(fā)菌株黑威半筋為對照菌株，進(jìn)行拮抗試驗[13]。選擇有明顯拮抗反應(yīng)的再生菌種進(jìn)行復(fù)篩試驗，包括萌發(fā)定植對比試驗[14]、生長速度和長勢對比試驗、營養(yǎng)生長酶活[15-19]對比試驗。

1.2.5 優(yōu)良菌種的真實性鑒定

經(jīng)初篩與復(fù)篩后，參考中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1730-2009食用菌菌種真實性鑒定ISSR法[20]，選擇性狀優(yōu)良的再生菌株與出發(fā)株采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行菌種真實性鑒定，確定其分子水平上的遺傳距離。

1.3 黑木耳細(xì)胞工程株發(fā)酵性能對比

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)

按液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行配制，250 mL三角瓶中裝液量100 mL，將PDA菌種以8%的接種量[10]轉(zhuǎn)接于制備好的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并于28℃、160 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)[10]，進(jìn)入搖床的第1天定時、定瓶（每隔8 h，每個菌種各3瓶） 取100 mL發(fā)酵全液進(jìn)行各項指標(biāo)檢測，并求平均值。

1.3.2 指標(biāo)數(shù)值檢測

采用菌絲鮮重評價生物量[21]；采用手持糖度計法測定殘?zhí)橇縖22]；采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[23]。

1.4 發(fā)酵菌種的生理指標(biāo)檢測

經(jīng)上述探究后，對較優(yōu)菌株進(jìn)行發(fā)酵液pH[22]、氨基氮含量[24]、羧甲基纖維素酶、漆酶、半纖維素酶[15-19]等生理活性指標(biāo)的檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變育種試驗結(jié)果

ARTP誘變菌絲體致死曲線見圖1。

圖1 ARTP誘變致死曲線Fig.1 Lethal curve of ARTP mutation

由圖1可知，在40 s時菌絲體的致死率為82.16%；45 s時菌絲體的致死率為91.08%；50 s時菌絲體的致死率為99.06%；55 s后致死率達(dá)到了100%。因此選用45 s為ARTP最佳誘變時間。

重復(fù)進(jìn)行ARTP誘變試驗，共獲得285株長勢良好的再生菌株，依次編號為 Aa1、Aa2、Aa3、Aa4、……Aa285。

2.2 再生菌株初篩結(jié)果

通過ARTP誘變得到的285株再生菌株與出發(fā)菌株進(jìn)行拮抗試驗后，共有36株與出發(fā)菌株產(chǎn)生明顯的拮抗反應(yīng)，突變率為12.6%。

2.3 再生菌株復(fù)篩結(jié)果

經(jīng)萌發(fā)定植對比試驗、生長速度和長勢對比試驗，對36株再生菌株進(jìn)行比較，有23株生長較慢，菌絲較為稀疏，菌絲體較弱而淘汰。余下菌株篩選后有6株明顯優(yōu)于出發(fā)株，其生長情況對比見表1。

表1 6株再生菌株生長情況對比Tab.1 Growth comparison of 6 regenerated strains

由表1可知，Aa229表現(xiàn)較差，在萌發(fā)時間與菌絲生長速度上均弱于出發(fā)株黑威半筋，Aa278、Aa285表現(xiàn)與出發(fā)株較為接近，而Aa66、Aa98、Aa101表現(xiàn)較好，且與出發(fā)株黑威半筋存在極顯著性差異。6株再生菌株營養(yǎng)生殖階段的多酚氧化酶、漆酶、羧甲基纖維素酶酶活的對比情況見表2。

表2 6株再生菌株酶活性對比Tab.2 Comparison of enzyme activities of 6 regenerated strains

由表2可知，6株再生株在3中酶的活性測定中存在差異。綜合比較而言，Aa229、Aa278表現(xiàn)較差；其余4株菌株強(qiáng)于出發(fā)株黑威半筋、Aa66、Aa98、Aa101、Aa285明顯與出發(fā)株具有顯著性與極顯著性差異；Aa66在3種酶的測定中表現(xiàn)最優(yōu)，且與出發(fā)株存在極顯著性差異。

2.4 菌株真實性鑒定結(jié)果

對篩選出的4株優(yōu)良菌株與出發(fā)株進(jìn)行ISSRPCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增圖譜見圖2。

圖2 部分引物對5個菌株的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.2 ISSR amplification map of 5 strains by partial primers

由圖2可知，在隨機(jī)挑選的30條引物中，共有10條引物的擴(kuò)增圖譜效果較好，穩(wěn)定合理且具有差異性。共獲得了42條擴(kuò)增條帶，每條引物可獲得2條～5條擴(kuò)增條帶，其中有27條擴(kuò)增條帶與出發(fā)株黑威半筋有差異，擴(kuò)增條帶大小在150 bp～2 000 bp內(nèi)。采用Ntsys 2.10e對4株優(yōu)良再生菌株以及出發(fā)菌株的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析，所構(gòu)建遺傳關(guān)系聚類樹形圖見圖3。

圖3 優(yōu)良再生株與出發(fā)株遺傳關(guān)系聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of genetic relationship between excellent regenerated plant and original plant

由圖3可知，4株優(yōu)良再生菌株與黑威半筋的變異范圍為0.650～0.880，表明4株優(yōu)良再生株均與出發(fā)株存在穩(wěn)定性差異。

2.5 液體發(fā)酵過程中生物量的變化

5株黑木耳菌株在液體培養(yǎng)過程中菌絲體鮮重變化結(jié)果見圖4。

圖4 5株黑木耳菌株在液體培養(yǎng)過程中菌絲體鮮重變化結(jié)果Fig.4 Changes of mycelial fresh weight of 5 strains of Auricularia auricula during liquid culture

由圖4可以得出，隨培養(yǎng)時間的增長，各菌株生物量均呈明顯上升趨勢。其中，4株優(yōu)良再生株最高生物量均高于出發(fā)株，但Aa285與其相差極小。觀察曲線走勢可看出，Aa101進(jìn)入增殖生長期時間較晚，且與其他3株細(xì)胞工程株相差較大。綜合比較而言，Aa66與Aa98表現(xiàn)較為優(yōu)良，均在48 h時進(jìn)入增值生長期，但Aa66較快的進(jìn)入穩(wěn)定期，在136 h時生物量達(dá)到最大值32.96 g·100-1mL-1，明顯高于Aa98，更具有優(yōu)勢。

2.6 液體發(fā)酵培養(yǎng)中殘?zhí)橇康淖兓?/h3>

5株黑木耳菌株液體培養(yǎng)過程中發(fā)酵液內(nèi)殘?zhí)堑淖兓Y(jié)果見圖5。

圖5 5株黑木耳菌株在液體培養(yǎng)過程中發(fā)酵液中殘?zhí)堑淖兓Y(jié)果Fig.5 Changes of residual sugar in fermentation broth of 5 strains of Auricularia auricula during liquid culture

由圖5可以得出，隨培養(yǎng)時間的增長，各菌株發(fā)酵液的殘?zhí)嵌染拭黠@下降趨勢，且與生物量的變化時間節(jié)點基本一致，這表明在菌絲生長的同時，會大量消耗碳源。對于碳源的分解能力依次為Aa66＞Aa98＞Aa101＞黑威半筋＞Aa285。

2.7 發(fā)酵液總多糖測定結(jié)果

5株黑木耳菌株發(fā)酵液多糖測定結(jié)果見表3。

表3 5株黑木耳菌株發(fā)酵液多糖測定結(jié)果Tab.3 Determination results of polysaccharides in fermented mash of 5 Auricularia auricular strains

在發(fā)酵培養(yǎng)過程中生物量達(dá)到最大時，取100 mL發(fā)酵液，經(jīng)勻質(zhì)機(jī)機(jī)械破碎，進(jìn)行發(fā)酵液總多糖含量的測定，4株再生菌株多糖量均高于出發(fā)株，其中Aa66、Aa98與出發(fā)株相比有極顯著差異，其中Aa66最佳。

2.8 再生株Aa66的生理指標(biāo)檢測結(jié)果

2.8.1 pH變化

再生株Aa66發(fā)酵過程中pH的變化情況見圖6。

圖6 pH變化情況Fig.6 Change of pH

如圖6所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液pH先下降后升高，但變化范圍較小，基本在5.5～7.4之間波動。

2.8.2 氨基氮含量測定結(jié)果

再生株Aa66發(fā)酵過程中氨基氮含量變化情況見圖7。

圖7 氨基氮含量變化Fig.7 Change of amino nitrogen content

如圖7所示，氨基氮含量隨發(fā)酵時間的上升呈增加趨勢，0～48 h時增加緩慢，48 h后增加較快。在160 h后，隨著生物量的下降，氨基氮含量呈上升趨勢，這表明在培養(yǎng)后期菌絲老化，發(fā)生菌球自溶現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)性蛋白快速分解，使得發(fā)酵液中氨基氮含量增多。

2.8.3 還原糖含量

再生株Aa66發(fā)酵過程中還原糖含量變化情況見圖8。

圖8 還原糖含量變化Fig.8 Change of reducing sugar content

如圖8所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，還原糖含量呈先增加后下降的趨勢，在遲緩期與對數(shù)生長期還原糖含量增加，表明在發(fā)酵初期菌絲體分解碳源能力較強(qiáng)，還原糖的生成量遠(yuǎn)大于消耗量，在120 h時，達(dá)到最大值76.66 mg·100-1mL-1。在對數(shù)生長期后期以及進(jìn)入穩(wěn)定期后，菌絲體大量生長，對于碳源的消耗能力進(jìn)一步提高，還原糖含量下降。

2.8.4 酶活性測定結(jié)果

再生株Aa66發(fā)酵過程中3種酶活性變化情況見圖9。

圖9 酶活性變化Fig.9 Changes of enzyme activity

如圖9所示，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，3種酶活性均先增高后下降。羧甲基纖維素酶活性變化明顯，在0～48 h幾乎沒有變化，48 h后開始增加，96 h后快速上升，在136 h時達(dá)到最大值70.01 U·mL-1。而半纖維素酶與漆酶酶活性變化較小，半纖維素酶酶活性在144 h時達(dá)到最大值4.92 U·mL-1，漆酶酶活在120 h時達(dá)到最大值7.94 U·mL-1。在對數(shù)生長期，菌絲體生長迅速，需要較多的養(yǎng)分，因此產(chǎn)生大量的酶進(jìn)行基質(zhì)的分解，酶活性也隨之升高。當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期，菌絲體產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物，此時對于養(yǎng)分需求逐步下降，導(dǎo)致酶的活力下降。由于酶易失活的特性，使其在后期呈直線下降。

3 討論

ARTP誘變育種作為一種微生物育種新技術(shù)，在細(xì)菌、放線菌、酵母菌上已有應(yīng)用，在食（藥）用真菌領(lǐng)域的應(yīng)用較少，而在黑木耳的誘變育種試驗中尚未報道。通過ARTP誘變育種技術(shù)，以黑威半筋為出發(fā)株，共獲得285株再生菌株，經(jīng)一系列篩選試驗后，共獲得4株性狀優(yōu)良的再生株。通過液體發(fā)酵試驗，對比其發(fā)酵性能，通過生物量、分解碳源的能力、多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，確定最適發(fā)酵菌株為Aa66。后續(xù)試驗需要對Aa66菌株發(fā)酵的過程進(jìn)行一系列生理指標(biāo)的檢測，為Aa66菌株在生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

在當(dāng)前食用菌的發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中，液體發(fā)酵工藝已取得規(guī)模性進(jìn)展，菌種作為生產(chǎn)的第一要素，對食用菌產(chǎn)量與質(zhì)量起決定性因素。細(xì)胞工程菌株Aa66是否可用于工業(yè)化生產(chǎn)，以及其在工業(yè)生產(chǎn)中實際的發(fā)酵性能，仍有待進(jìn)一步探究。