蘇心怡 唐智群 吳紅崑

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性退行性病變，為最常見的老年癡呆，臨床主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的認(rèn)知能力下降和人格改變[1]。AD 的臨床病理特征是β 淀粉樣蛋白(Aβ)積聚形成的老年斑、tau 蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失及炎癥反應(yīng)[2]。β 淀粉樣蛋白(Aβ)是一系列長度為38～43 個(gè)氨基酸的短肽，而Aβ42和Aβ40是人體內(nèi)最常見的具有毒性作用的亞型[3]，被認(rèn)為在AD 的神經(jīng)元丟失和認(rèn)知功能障礙中起著關(guān)鍵作用[4]。大腦中的Aβ 由中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)的淀粉樣前體蛋白(APP)的異常降解生成，即APP 在β-分泌酶1(BACE-1)的作用下首先水解成β-N 端片段和β-C 端片段，再由γ-分泌酶水解生成Aβ 肽段[5]。而早老素是γ 分泌酶的催化活性中心。早老素1(PS-1)和早老素2(PS-2)是早老素的兩個(gè)亞型，有類似的生物學(xué)功能，兩者的異常表達(dá)能影響γ 分泌酶對(duì)APP 的裂解作用，從而影響Aβ 的生成[6]。

牙周炎是一種發(fā)生在牙周組織的慢性感染性疾病，P.gingivalis 是其主要致病菌之一。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)牙周炎和P.gingivalis 是AD 的重要危險(xiǎn)因素[7]。牙周炎患者中出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的比率是非牙周炎患者的2.4 倍[8]。臨床附著喪失與腦組織中Aβ 的沉積量存在正相關(guān)關(guān)系。Ilievski 等發(fā)現(xiàn)P.gingivalis 誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎能誘發(fā)小鼠海馬組織中Aβ42的沉積[9]。Stephen S 等學(xué)者在AD 患者的腦脊液中檢測(cè)出了P.gingivalis 的DNA，且發(fā)現(xiàn)P.gingivalis 經(jīng)口腔感染小鼠后，可進(jìn)入小鼠海馬組織并誘導(dǎo)Aβ42的生成[10]。但是，P.gingivalis對(duì)腦組織中Aβ42的影響機(jī)制尚未完全明確。本研究通過建立P.gingivalis 靜脈感染野生型SD 大鼠模型，研究P.gingivalis 對(duì)SD 大鼠海馬組織中Aβ42的影響，并進(jìn)一步分析其可能的作用機(jī)制，為通過牙周疾病的防治降低AD 的發(fā)病率提供理論依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 細(xì)菌的培養(yǎng)與鑒定 牙齦卟啉單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33277(口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)復(fù)蘇后接種在含羊血的腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth，BHI)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)5～7 天，革蘭氏染色鑒定確認(rèn)無污染后，于BHI 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，收集菌體，離心5min(12000 rpm，4℃)，收集沉淀于無菌PBS 中重懸2 次，使用麥?zhǔn)媳葷醿x將菌液濃度調(diào)整至108CFU/ml，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 大鼠靜脈感染模型的建立 SPF 級(jí)SD 大鼠40 只，雄性，3 月齡，體重200±10g，購自四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。隨機(jī)分為4 組，每組10 只，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尾靜脈注射P.gingivalis 懸濁液(108CFU/ml，200ul/只，3 次/周)，對(duì)照組注射等量的PBS 溶液。兩組注射4 周，兩組注射12 周[11]，每組大鼠最后一次注射24 小時(shí)后采用安樂法處死。每組6 只行多聚甲醛灌注后，取腦組織，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)，每組4 只取海馬組織，液氮保存，用于蛋白表達(dá)的檢測(cè)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，并獲得四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)為WCHSIRB-D-2017-001)。

1.3 Western Blot 取海馬組織，蛋白裂解液提取蛋白，BCA 試劑盒(碧云天，中國)檢測(cè)蛋白濃度。十二烷基聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶室溫封閉1h后，以兔Aβ42多克隆抗體(1∶2000,博奧森，北京)，兔Aβ40多克隆抗體(1∶1000,博奧森，北京)、兔APP 多克隆抗體(1∶1000,博奧森，北京)、小鼠BACE-1 單克隆抗體(1∶1000,SANTA CRUZ，美國)、小鼠PS-1 單克隆抗體(1∶1000,SANTA CRUZ，美國)、小鼠PS-2 單克隆抗體(1∶1000,SANTA CRUZ，美國)、小鼠β-actin 單克隆抗體(1∶1000,SANTA CRUZ，美國)4℃下孵育過夜。次日，使用相應(yīng)來源的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000,博奧森，北京)37℃搖床上孵育1h，TBST洗滌3 次，DAB 試劑盒顯影，采圖后quantity one分析軟件分析蛋白灰度值并與內(nèi)參(β-actin)相比較，得到待測(cè)蛋白的相對(duì)百分?jǐn)?shù)。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 腦組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，標(biāo)本切片，將處理好的切片以1∶200的兔Aβ42多克隆抗體(博奧森，北京)4℃下孵育過夜。次日，使用稀釋比例為1∶500 的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗(博奧森，北京)37℃搖床上孵育30 min，PBS 洗滌3 次，DAB(中杉金橋，北京)顯色，復(fù)染，中性樹膠封片，使用BA200Digital 數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集。每只大鼠選取3 張切片，每張切片先于100 倍下觀察全部組織，再選取3 個(gè)視野分別采集400 倍顯微圖像。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS19.0 軟件對(duì)分組大于或等于3 的計(jì)量資料采用單因素方差分析，分組小于3 的計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 Aβ42和Aβ40表達(dá)水平 Western blot 檢測(cè)4 周及12 周組SD 大鼠海馬組織中Aβ42和Aβ40的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1 所示：4 周實(shí)驗(yàn)組Aβ42的相對(duì)表達(dá)量為0.228±0.032，4 周對(duì)照組Aβ42的相對(duì)表達(dá)量為0.122±0.012，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；12 周實(shí)驗(yàn)組Aβ42的相對(duì)表達(dá)量為0.296±0.03，12 周對(duì)照組Aβ42的相對(duì)表達(dá)量為0.098±0.019，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；且12 周實(shí)驗(yàn)組Aβ42的相對(duì)表達(dá)量明顯高于4 周實(shí)驗(yàn)組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。4 周實(shí)驗(yàn)組Aβ40的相對(duì)表達(dá)量為1.386±0.390，4 周對(duì)照組Aβ40的相對(duì)表達(dá)量為0.975±0.234，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；12 周實(shí)驗(yàn)組Aβ40的相對(duì)表達(dá)量為1.263±0.263，12 周對(duì)照組Aβ40的相對(duì)表達(dá)量為1.200±0,130，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。弱陽性的表達(dá)。

圖1 Aβ42 和Aβ40 的表達(dá)水平(-代表對(duì)照組，+代表實(shí)驗(yàn)組,*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)

圖2 Aβ42 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Aβ42 的沉積位點(diǎn)×400

2.3 Aβ42相關(guān)蛋白BACE-1、APP、PS-1、PS-2 的表達(dá)水平 選取Aβ42表達(dá)水平差異更明顯的12 周組大鼠的海馬組織，采用Western blot 檢測(cè)BACE-1、APP、PS-1、PS-2 的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3 顯示：實(shí)驗(yàn)組APP 的相對(duì)表達(dá)量為0.840±0.171,對(duì)照組為0.491±0.073,實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組中PS-1 的相對(duì)表達(dá)量為1.672±0.208，2.2Aβ42的免疫組織化學(xué)染色 上述實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)P.gingivalis 靜脈感染后，SD 大鼠海馬組織中Aβ40的表達(dá)并無明顯變化，而Aβ42表達(dá)上調(diào)，因此，我們只針對(duì)Aβ42做了免疫組織化學(xué)的檢測(cè)。結(jié)果如圖2 所示：4 周及12 周實(shí)驗(yàn)組Aβ42的表達(dá)集中于神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)，呈棕黃色，量大且密集，而4 周及12 周對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中Aβ42表達(dá)接近陰性，細(xì)胞間質(zhì)中有少量、散在、其在對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量為1.083±0.118，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。PS-2 在實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量為0.573±0.132，對(duì)照組為0.491±0.073，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而實(shí)驗(yàn)組BACE-1的相對(duì)表達(dá)量為0.546±0.075，對(duì)照組BACE-1的相對(duì)表達(dá)量為0.391±0.108，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖3 Western Blot 檢測(cè)Aβ42 相關(guān)蛋白BACE-1、APP、PS-1、PS-2 的表達(dá)水平(**P＜0.01)

3.討論

以牙周感染為典型代表的口腔感染是菌血癥的常見誘因[12]，而P.gingivalis 是牙周炎的主要致病菌，在牙周袋中的濃度可以達(dá)到108CFU/mL[13]。P.gingivalis 有大量的毒力因子，除能引發(fā)牙周組織的炎癥外，還能通過糜爛的牙周組織進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，定植在遠(yuǎn)端器官[14]，影響多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)展，如動(dòng)脈粥樣硬化[15]、冠心病[16]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[17]等。有研究表明對(duì)ApoE 基因敲除小鼠行頻率為3 次/周的P.gingivalis 培養(yǎng)液尾靜脈注射4 周可加速其氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化[11]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)P.gingivalis 經(jīng)尾靜脈感染SD 大鼠4 周和12 周可提高其血清及海馬組織中炎性因子IL-1β(白細(xì)胞介素1β)、IL-6(白細(xì)胞介素6)、TNF-α(腫瘤壞死因子α)水平[18]并促進(jìn)海馬組織中神經(jīng)元的凋亡[19]，我們推測(cè)P.gingivalis進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)引起循環(huán)系統(tǒng)炎癥及神經(jīng)炎癥可能是引發(fā)海馬組織中AD 樣病變的一個(gè)重要途徑[20]。因此，本研究采用經(jīng)尾靜脈注射P.gingivalis 的方式建立P.gingivalis 外周感染模型，探討P.gingivalis對(duì)Aβ42和Aβ40的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)SD 大鼠經(jīng)靜脈感染P.gingivalis 后，海馬組織中可溶性的Aβ40沒有明顯變化，但可溶性Aβ42的表達(dá)明顯增加，并且隨著感染時(shí)間的延長，這種上調(diào)作用更加明顯。過表達(dá)的Aβ42主要沉積于海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)中。這與Ilievski 等發(fā)現(xiàn)P.gingivalis 誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎可以誘發(fā)小鼠海馬組織中Aβ42的沉積[9]，以及Stephen S等發(fā)現(xiàn)P.gingivalis 感染小鼠口腔可誘導(dǎo)Aβ42的生成一致[10]。Aβ42是AD 樣病變中主要的、標(biāo)志性的淀粉樣沉積物[20]，腦內(nèi)沉積的Aβ42可以激活caspase信號(hào)通路，誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)元凋亡[19,21]。

為了進(jìn)一步探討P.gingivalis 影響Aβ42表達(dá)水平的機(jī)制，課題組進(jìn)一步分析了SD 大鼠海馬組織中Aβ42相關(guān)蛋白BACE-1、APP、PS-1、PS-2的表達(dá)。APP 是Aβ 的前體蛋白，APP 過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，6～9 月齡時(shí)即可見腦組織中Aβ 斑塊的沉積[22]，而γ 分泌酶是Aβ 生成終末環(huán)節(jié)的關(guān)鍵酶，其活性的高低與是否能生成Aβ 密切相關(guān)。PS-1、PS-2 蛋白是γ 分泌酶重要組成部分，兩者的基因突變可導(dǎo)致改變?chǔ)?分泌酶活性，引起Aβ42的選擇性過表達(dá)[23,24]。本研究發(fā)現(xiàn)SD 大鼠經(jīng)靜脈感染P.gingivalis 后，海馬組織中APP、PS-1、PS-2 的表達(dá)都出現(xiàn)了上調(diào)。這與以往研究中包柔螺旋體能通過上調(diào)APP 促進(jìn)神經(jīng)元分泌Aβ42[25]，以及幽門螺桿菌通過上調(diào)PS-2 促進(jìn)SD 大鼠海馬組織中Aβ42的表達(dá)[26]相符。同時(shí)與Ilievski 等發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎能上調(diào)小鼠海馬組織中APP 基因表達(dá)的結(jié)果一致[9]。我們推測(cè)P.gingivalis 可能是通過上調(diào)APP 的表達(dá)，增加了Aβ42的來源，同時(shí)又上調(diào)PS-1、PS-2 的表達(dá)，增加γ 分泌酶的活性，從而使Aβ42的表達(dá)增多。

4.結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)P.gingivalis 經(jīng)靜脈感染SD 大鼠后，能促進(jìn)大鼠海馬組織中神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)中Aβ42的表達(dá)，其機(jī)制可能為P.gingivalis上調(diào)了Aβ42前體蛋白APP 及γ 分泌酶活性組成成分PS-1、PS-2 的表達(dá)。但APP、PS-1、PS-2介導(dǎo)P.gingivalis 促進(jìn)SD 大鼠海馬組織中Aβ42過表達(dá)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。