彭思可 蔡 晶 張 媛

宮頸癌(cervical cancer，CC)是世界范圍內(nèi)第2常見的女性生殖道惡性腫瘤，發(fā)生率逐年上升，發(fā)病年齡趨于年輕化。盡管宮頸癌疫苗、根治性手術(shù)和放化療已廣泛用于預(yù)防和治療宮頸癌，但全球每年仍有50多萬(wàn)新增病例[1]。耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是病死率高的主要原因，這與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)有關(guān)。TME主要由腫瘤細(xì)胞、骨髓源性細(xì)胞和宿主間質(zhì)細(xì)胞組成，它們相互作用，形成免疫抑制微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[2]。眾多研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)在宮頸癌進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，并在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成、免疫抑制等方面與不良預(yù)后相關(guān)。本文將對(duì)巨噬細(xì)胞的來(lái)源和分類、宮頸癌中參與TAMs形成和活化的分子、巨噬細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物、TAMs上PD-1的表達(dá)情況以及在CC研究中針對(duì)TAMs治療的研究現(xiàn)狀展開綜述。

一、巨噬細(xì)胞的來(lái)源與分類

1.組織駐留巨噬細(xì)胞：參與宮頸癌病理生理過程的巨噬細(xì)胞有兩種：組織駐留巨噬細(xì)胞和浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞。在胚胎器官發(fā)育過程中，來(lái)自卵黃囊和胎兒肝前體細(xì)胞的巨噬細(xì)胞駐留在正常、未受傷或發(fā)炎組織的上皮內(nèi)或上皮上[3]。這些巨噬細(xì)胞作為常駐的、自我維持的群體存留至成年。出生后，骨髓或脾臟來(lái)源的單核細(xì)胞可在損傷、感染或炎性反應(yīng)后補(bǔ)充組織駐留的巨噬細(xì)胞。組織駐留的巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是分化的單核細(xì)胞，其駐扎在組織中執(zhí)行免疫哨兵和維持穩(wěn)態(tài)的功能。然而，組織駐留的巨噬細(xì)胞并不是一個(gè)同質(zhì)群體，而是一組具有相似功能和表型的細(xì)胞。目前已有研究證明，組織環(huán)境本身是巨噬細(xì)胞表型的主要控制因子，并且可以影響巨噬細(xì)胞許多基因的表達(dá)，而不受其來(lái)源的影響[4]。這些巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)代謝和介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。骨破骨細(xì)胞、腦小膠質(zhì)細(xì)胞、肝臟中的庫(kù)普弗細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞具有共同的功能，但也高度適應(yīng)于它們的器官特異性用途[5]。

2.浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞：與組織駐留巨噬細(xì)胞不同，浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞來(lái)源于骨髓，它們的壽命相對(duì)較短，需要從循環(huán)單核細(xì)胞中不斷補(bǔ)充。循環(huán)單核細(xì)胞被多種炎性介質(zhì)招募到腫瘤、炎癥或感染組織中，從而獲得浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的特性。與組織駐留巨噬細(xì)胞相似，浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞可以感知局部環(huán)境的變化，并分化為特異性巨噬細(xì)胞群，促進(jìn)組織穩(wěn)態(tài)、免疫和炎癥。腫瘤免疫抑制微環(huán)境破壞了新招募單核細(xì)胞的正常生理功能(抗原遞呈和細(xì)胞毒性功能)，使其分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)。組織中單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞在經(jīng)歷生長(zhǎng)因子、代謝需求、局部氧張力、組織細(xì)胞和基質(zhì)等各種因素的影響后往往具有高度的異質(zhì)性[5]。浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞主要分為M1型和M2型。Th1細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-12、TNF-α、細(xì)菌成分如脂多糖和Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑等可誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞的極化[6]。M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23、iNOS、TNF-α、CXCL-9和CXCL-10等，并表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(MHCⅠ)和Ⅱ類(MHCⅡ)分子[7]。因此，M1型巨噬細(xì)胞參與炎性反應(yīng)和抗腫瘤免疫。相反，M2型巨噬細(xì)胞由Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α、TGF-β、GM-CSF、免疫復(fù)合物和TLRs等誘導(dǎo)形成，分泌多種抗炎性細(xì)胞分子，如IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β、維生素D3、糖皮質(zhì)激素和精氨酸酶1等，發(fā)揮抗炎和促腫瘤活性[6,8]。巨噬細(xì)胞可以同時(shí)具有殺瘤和致瘤的特性，這取決于細(xì)胞類型和信號(hào)微環(huán)境。在癌癥背景下，M1型可通過細(xì)胞毒性和吞噬作用發(fā)揮殺傷腫瘤作用。而M2型與不良預(yù)后相關(guān)，其血管生成和免疫抑制功能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

二、TAMs的形成

腫瘤組織間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞增殖形成TAMs的一部分，循環(huán)單核細(xì)胞的招募也是TAMs積累的必要條件。來(lái)自腫瘤和宿主細(xì)胞的信號(hào)共同形成了TAMs的功能表型。在CC中，TAMs的形成主要與腫瘤源性分子、T細(xì)胞源性分子、精漿源性分子、厭氧微環(huán)境和其他來(lái)源的分子有關(guān)[8]。

1.腫瘤源性分子：TAMs的形成與腫瘤及腫瘤源性分子關(guān)系密切。Colegia等[9]研究證明了腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸，作為有氧或無(wú)氧糖酵解的副產(chǎn)品，可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的M2型分化，并對(duì)腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞具有重要意義。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，用宮頸癌細(xì)胞的上清液培養(yǎng)單核細(xì)胞時(shí)，其趨化、吞噬和調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖的功能被顯著抑制，且M1型巨噬細(xì)胞出現(xiàn)M2型特征，CD163、TLR-3、TLR-7、TLR-9和IL-10等的表達(dá)也上調(diào)[10]。核磷脂蛋白β1(karyopherin β1)是一種核導(dǎo)入蛋白，參與轉(zhuǎn)運(yùn)含有核定位序列的蛋白。如圖1所示，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1通過啟動(dòng)與炎癥和癌細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的多種因子的表達(dá)，調(diào)控TAMs的分化[11]。抑制HeLa細(xì)胞karyopherin β1的表達(dá)可降低NF-κB和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，減少宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[12]。Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α、GM-CSF等也是NF-κB和AP-1的靶向基因，而這些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型分化[6]。這些結(jié)果提示karyopherin β1可能參與誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞分化。

CCR2-CCL2通路是腫瘤中單核細(xì)胞募集和功能定位的重要決定因素。趨化因子CCL2可以影響巨噬細(xì)胞的極化程度，因?yàn)镃CL2增強(qiáng)了脂多糖誘導(dǎo)的IL-10的產(chǎn)生，而CCL2的阻斷可導(dǎo)致人巨噬細(xì)胞M1型分化相關(guān)基因和細(xì)胞因子的表達(dá)增強(qiáng)，M2型相關(guān)標(biāo)記的表達(dá)減少[12,13]。CC細(xì)胞中CCL2 mRNA表達(dá)水平與TAMs數(shù)量呈正相關(guān)[13]。宮頸癌進(jìn)展與血清中粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)水平升高有關(guān)。研究表明，CC細(xì)胞表達(dá)GM-CSF的水平與TAMs的數(shù)量呈正相關(guān)，且GM-CSF可以激活TAMs釋放促腫瘤因子[14]。IL-10可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括HPV轉(zhuǎn)化的宮頸癌細(xì)胞。IL-10可通過上調(diào)IL-4Rα和IL-4R依賴性精氨酸酶1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型活化。此外，IL-10可促進(jìn)精氨酸酶在脂多糖中的表達(dá)，使巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能[15]。

癌蛋白可促進(jìn)細(xì)胞中參與TAMs形成的分子的產(chǎn)生。研究數(shù)據(jù)表明，HPV感染后，HPV E2、E6、E7蛋白可促進(jìn)IL-10的表達(dá)，而IL-10又會(huì)刺激HPV E6和E7的表達(dá)[16]。IL-10參與細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞的分化，而M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平的IL-10[10～13,16]。因此，HPV癌蛋白和IL-10之間的相互作用形成了一個(gè)惡性循環(huán)，可能有利于宮頸癌組織內(nèi)免疫抑制微環(huán)境的形成。此外，王軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)高危型HPV16 E6蛋白可上調(diào)宮頸癌細(xì)胞外泌體中熱休克蛋白HSP70的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-10，并介導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

2.T細(xì)胞源性分子：T細(xì)胞通過分泌特異性分子，可能影響單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化。巨噬細(xì)胞活化途徑分別為經(jīng)典活化途徑和選擇性活化途徑。經(jīng)典的活化途徑被定義為Th1細(xì)胞因子γ干擾素 (IFN-γ)或細(xì)菌產(chǎn)物如脂多糖刺激巨噬細(xì)胞M1型分化。 Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β、糖皮質(zhì)激素、維生素A等抗炎性細(xì)胞因子作用引起的巨噬細(xì)胞M2型分化屬于選擇性活化途徑[17]。M2型巨噬細(xì)胞在被T淋巴細(xì)胞受體激動(dòng)劑激活后，共刺激分子的表達(dá)降低，IL-12p70和IL-10的平衡改變，以及刺激T細(xì)胞增殖和IFN-γ生成的能力下降，這就形成了腫瘤免疫抑制微環(huán)境[18]。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞可組成性表達(dá)IL-4，IL-4已被證實(shí)可以通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子kruppel-like factor 4 (KLF4)，促進(jìn)骨髓源性巨噬細(xì)胞向M2型分化[19]。激活的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17可增加宮頸癌細(xì)胞系IL-6的分泌，而IL-6對(duì)M2型巨噬細(xì)胞的分化具有重要作用。IL-17引起的腫瘤生長(zhǎng)增強(qiáng)與IL-6的表達(dá)增加以及腫瘤部位巨噬細(xì)胞的招募有關(guān)[20]。以上結(jié)果提示IL-17可能參與了浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的分化。

圖1 TAMs的招募與分化調(diào)控[11]

3.精漿源性分子和厭氧微環(huán)境:由于男性伴侶的精液是免疫調(diào)節(jié)前列腺素和細(xì)胞因子的復(fù)雜混合物，精液暴露可能影響女性生殖器炎癥微環(huán)境。用正常精漿對(duì)宮頸細(xì)胞進(jìn)行體外刺激，發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-8和GM-CSF的分泌濃度顯著升高，PGE2和IL-6對(duì)M2型巨噬細(xì)胞分化也有作用[20,21]。這表明精漿可能通過前列腺素影響宮頸癌巨噬細(xì)胞的分化。

TME缺氧啟動(dòng)宮頸癌細(xì)胞中神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin-1，Nrp-1)的過表達(dá)，從而招募并使巨噬細(xì)胞向M2型分化。Nrp-1和M2型TAMs已被證實(shí)與宮頸癌FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[22]。

三、TAMs的生物學(xué)標(biāo)志物

科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，宮頸癌CD68+TAMs呈CXCL10(M1型)/CD163+(M2型)混合型，但大多為M2型[9]。CC腫瘤間質(zhì)中存在M1型巨噬細(xì)胞，其IL-6、TNF-α和iNOS等M1型標(biāo)志物表達(dá)下降，并在腫瘤細(xì)胞的影響下易于向M2型轉(zhuǎn)化。CC研究中，用于M1型巨噬細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物有CD163-、CD163+pSTAT1、CD68+pSTAT1+、IL-6、TNF-α、iNOS、IL-12p40、CD80+、HLA-DR和CXCL10(圖1)；M2型最常見的標(biāo)志物是CD163+，其他標(biāo)志物有CD206+、IL-10、CD14+、CD11b+、CD204+、CD163+c-MAF+、CD68+c-MAF+、HIF-1α、PPARγ、Arg-1、Ym1、CD14+PD-L1+和CD163+CD14+[11,17]。

四、PD-1在TAMs上的表達(dá)

程序性死亡受體1(programmed cell death protein-1，PD-1)，也稱CD273，是一種免疫檢查點(diǎn)受體，主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞和前體B細(xì)胞，可介導(dǎo)機(jī)體免疫耐受。腫瘤細(xì)胞則通常過表達(dá)PD-1的配體，即程序性細(xì)胞死亡配體1 (programmed cell death ligand 1，PD-L1)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃避。雖然PD-1/PD-L1阻斷激活T細(xì)胞已經(jīng)得到證實(shí)，但該通路在TAMs上的作用尚不清楚。相較于活化的T淋巴細(xì)胞，PD-1在巨噬細(xì)胞上的表達(dá)水平較低，且需要脂多糖、NF -κB和α-干擾素等的刺激[23]。此外，PD-L1在TAMs上強(qiáng)表達(dá)，這可能導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭和介導(dǎo)腫瘤的免疫抑制。因此，阻斷PD-L1對(duì)巨噬細(xì)胞的作用，增加T細(xì)胞的活化，從而增強(qiáng)抗腫瘤作用[24]。Gordon等[25]在小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)TAMs上PD-1的表達(dá)隨著時(shí)間的推移而增加，并且在原發(fā)性人類癌癥中隨著疾病的進(jìn)展而增加。PD-1+的TAM可表現(xiàn)為M2型，而PD-1-TAM的表達(dá)譜則與M1型相似。TAM PD-1表達(dá)情況與對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬能力呈負(fù)相關(guān)，體內(nèi)阻斷PD-1/PD-L1通路可以增加巨噬細(xì)胞的吞噬能力，減緩腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)腫瘤模型小鼠的生存時(shí)間，并呈巨噬細(xì)胞依賴的模式。研究結(jié)果表明，PD-1/PD-L1療法也可能通過對(duì)巨噬細(xì)胞的直接影響發(fā)揮作用，且2020年NCCN指南已將抗PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑派姆單抗列為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性PD-L1陽(yáng)性宮頸癌首選二線治療方案，這對(duì)宮頸癌的免疫治療具有重要意義[26]。

五、靶向TAMs的宮頸癌治療

巨噬細(xì)胞是腫瘤炎性微環(huán)境的重要組成部分。巨噬細(xì)胞的可塑性使腫瘤免疫治療過程中改變腫瘤微環(huán)境和重建抗腫瘤免疫成為可能。靶向TAMs的主要治療策略包括抑制M2型巨噬細(xì)胞的活化，阻止單核細(xì)胞向腫瘤組織募集，激活巨噬細(xì)胞吞噬活性，阻斷PD-1/PD-L1通路對(duì)巨噬細(xì)胞的作用以增加T細(xì)胞的活化[27]。

現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)表明，代表所有活化巨噬細(xì)胞的CD68+巨噬細(xì)胞并不是預(yù)后標(biāo)志物，而M2型巨噬細(xì)胞與CC的關(guān)系具有特異性[28,29]。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本中腫瘤內(nèi)M2型TAMs的數(shù)量顯著高于非腫瘤樣宮頸標(biāo)本中上皮內(nèi)M2型TAMs的數(shù)量，宮頸鱗狀細(xì)胞癌瘤周M2型TAMs的數(shù)量高于宮頸非腫瘤組織[28]。此外，宮頸腺癌中腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D204+M2型巨噬細(xì)胞密度較高，與較短的無(wú)病生存顯著相關(guān)[29]。

由于M2型TAMs被證明有致瘤作用，而M1型TAMs在CC中具有抗腫瘤作用，一些研究者開始關(guān)注M2型向M1型的轉(zhuǎn)化，認(rèn)為這可能是治療上的突破。Gordon等[25]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)PD-1敲除后，用酵母聚糖誘發(fā)炎性反應(yīng)，可使巨噬細(xì)胞向M1型分化，這可能與PD-1敲除后胞內(nèi)STAT1/NF-κB活化增強(qiáng)以及STAT6信號(hào)通路活化減弱相關(guān)。Heusinkveld等研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞與CD4+Th1細(xì)胞相互作用后，可轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨腗1型巨噬細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)高水平的共刺激分子，獲得淋巴歸巢標(biāo)志物CCR7，從而形成抗腫瘤微環(huán)境[20]。然而，M2型巨噬細(xì)胞與Th1細(xì)胞作用的具體機(jī)制暫不清楚。Saito等[30]研究發(fā)現(xiàn)，重組人血清素-干擾素(rIFN-γ)對(duì)宮頸癌細(xì)胞系具有直接的劑量依賴性抑制作用。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，用rIFN-γ處理后，人腹腔積液細(xì)胞(>80%的巨噬細(xì)胞)對(duì)卵巢癌和黑色素瘤細(xì)胞株的集落生長(zhǎng)均有很強(qiáng)的抑制作用。雖然缺乏直接證據(jù)，但這些結(jié)果暗示TAMs可能在rIFN-γ的影響下產(chǎn)生一種可擴(kuò)散物質(zhì)，在CC中成為殺瘤物質(zhì)。此外，Nrp-1在宮頸癌缺氧TME誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型分化和促腫瘤作用中起關(guān)鍵作用，干擾Nrp-1可能是治療宮頸癌的一種潛在的治療策略[22]。

六、展 望

綜上所述，循環(huán)單核細(xì)胞受多種炎性細(xì)胞因子調(diào)控被招募至宮頸癌局部病變組織中，并分化為M1型和M2型巨噬細(xì)胞，參與腫瘤免疫和免疫逃避。在腫瘤進(jìn)展過程中，來(lái)自CC細(xì)胞的分子如HPV癌蛋白，特別是E6和E7，是影響巨噬細(xì)胞分化的初始因素。此外，T淋巴細(xì)胞、精漿和厭氧微環(huán)境等的相關(guān)分子也在巨噬細(xì)胞分化和選擇性活化中起著重要作用。由于M1型巨噬細(xì)胞在CC中發(fā)揮抗腫瘤作用，而M2型巨噬細(xì)胞有致瘤作用，故M2型向M1型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化引起了研究者們的關(guān)注，這或許將成為腫瘤治療的新方向。PD-1+TAMs與M2型巨噬細(xì)胞表型相似，在抗PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療宮頸癌中發(fā)揮著重要作用。TAMs作為新的免疫治療的靶點(diǎn)，具有巨大潛力，將對(duì)宮頸癌的治療產(chǎn)生重要影響。