秦 雨，張彩鳳，辛夢茹，孫利芹 *，孫永軍

（1.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264000；2.好當(dāng)家集團(tuán)有限公司，山東 威海 264200）

扇貝是我國重要的經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)品之一，自20世紀(jì)70年代末隨著海水養(yǎng)殖第三次浪潮的來臨，扇貝的養(yǎng)殖量以及凍貝柱、干貝柱的加工和出口量越來越大，在海洋經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。但是在扇貝柱加工過程中，大量扇貝裙邊被棄于海邊，只有小部分扇貝裙邊作為蝦飼料低價出售，在造成海洋污染的同時，也使得生物資源不能得到有效利用，造成資源的浪費(fèi)[1-3]。海鮮醬油利用低值魚、蝦、貝類及扇貝裙邊下腳料等為原料制作，口味鮮美，營養(yǎng)豐富，具備普通醬油沒有的抗腫瘤、抗衰老等多種生理功能[4-5]。目前，日本和韓國等國家海鮮釀造醬油產(chǎn)品的品種和市場份額占比較多[6]，而在中國的調(diào)味品市場上，海鮮醬油品種較少。隨著人民生活水平的提高以及對健康、時尚飲食的追求，傳統(tǒng)醬油已經(jīng)不能滿足人們飲食方式多樣性的需求，開發(fā)研究新型海鮮醬油有廣闊市場前景。

發(fā)酵醬油的風(fēng)味成分組成復(fù)雜，受原料、微生物、發(fā)酵工藝條件[7-10]的影響。傳統(tǒng)醬油的發(fā)酵生產(chǎn)工藝通常有低鹽固態(tài)發(fā)酵法和高鹽稀態(tài)發(fā)酵法兩種，前者由于在原料全氮利用率方面較低（通常僅為68%左右），故包括日本在內(nèi)的國家通常采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵法，其平均全氮利用率可達(dá)83%左右[11]。我國傳統(tǒng)醬油釀造經(jīng)過多年的發(fā)展，工藝技術(shù)已處于領(lǐng)先水平，但關(guān)于海鮮醬油產(chǎn)品的開發(fā)和釀造工藝研究尚處于初級階段，市面上的產(chǎn)品多是以酶解工藝獲得的富含氨基酸的鮮味劑為主，全發(fā)酵型的海鮮醬油產(chǎn)品極少[12-13]。關(guān)于發(fā)酵工藝的研究多集中在菌種的篩選和酶解條件研究[14-15]，少數(shù)的研究集中在對發(fā)酵工藝技術(shù)的探討，如丁琦等[16-18]研究采用低鹽固態(tài)發(fā)酵法釀造扇貝裙邊醬油和牡蠣醬油，但所建立的工藝存在氨基多糖、?；撬峁δ艹煞只钚砸妆黄茐?，總酸含量高、酯化不充分[19]，影響口感等不足；許旖旎[20]采用吸附加包埋技術(shù)，將乳酸菌、酵母菌、紅曲霉共同固定，建立混合細(xì)胞發(fā)酵固定化體系。在眾多報道中，對高鹽稀態(tài)發(fā)酵法釀造海鮮醬油的報道并不多，發(fā)酵工藝還有待深入研究。

鑒于上述背景，本研究充分利用黃渤海扇貝養(yǎng)殖與加工的優(yōu)勢，從廢棄資源高值化利用的角度，在霉菌菌株優(yōu)化篩選的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究高鹽稀態(tài)發(fā)酵法制作扇貝裙邊海鮮醬油的工藝條件，以便為豐富我國高品質(zhì)海鮮醬油市場，實(shí)現(xiàn)廢棄資源的高值化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

扇貝裙邊（含水量55%～65%）：采集于煙臺周邊扇貝養(yǎng)殖企業(yè)；米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.042：煙臺大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏；黑曲霉（Aspergillus oryzae）As3.350：購自上海釀造研究所；某品牌海鮮醬油（高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝釀造）：市售；福林酚試劑：上海荔達(dá)生物科技有限公司；L-酪氨酸：上海伊卡生物技術(shù)有限公司；乙酸：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；苯酚、無水碳酸鈉、葡萄糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX系列立式高壓蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-1200型紫外可見分光光度計(jì)：翱藝儀器有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、DHG-9140電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；2 L高鹽稀態(tài)發(fā)酵罐：本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 制曲方法

表1 制曲初始原料配比Table 1 Initial proportion of raw materials for koji-making

豆粕或扇貝裙邊（表1）加水（豆粕∶水=1∶1.5（g∶mL）），在60 ℃條件下潤水40 min，自然pH，在121 ℃條件下于滅菌鍋中蒸料20 min，趁熱將結(jié)塊的曲揺散，再加入粗麥粉，121℃滅菌20 min，趁熱揺散。曲料中含水量約為30%～35%，曲料松散不成團(tuán)。冷卻后，分開接種米曲霉As3.042和黑曲霉As3.350，接種量為108個孢子/100 g。將曲均勻搖散后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)并于曲面發(fā)白結(jié)塊時翻曲，培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時間。

1.3.3 發(fā)酵工藝方法

按表2的成曲復(fù)配比例以及扇貝裙邊添加量上罐裝料，料液比=100∶250（g∶mL），鹽水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，發(fā)酵前30 d溫度為15 ℃，后150 d溫度為30 ℃，發(fā)酵35 d左右（發(fā)酵液pH＜5.2）時加入酵母菌[21]，添加量為100～110 CFU/mL，定期取樣檢測。

1.3.4 測定方法

蛋白酶活力的測定采用福林酚法[22]：成曲糖化酶活力和淀粉酶活力測定采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[22]。

氨基酸態(tài)氮、總酸的測定：采用甲醛滴定法[22]；可溶性無鹽固形物的測定：硝酸銀滴定法[22]；總氮的測定：采用凱氏定氮法[22]；氨基多糖的測定：采用苯酚-硫酸法[22]；牛磺酸的測定：采用分光光度法[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 扇貝裙邊添加比例和制曲時間的確定

分別以米曲霉As3.042和黑曲霉As3.350兩種成曲產(chǎn)蛋白酶、糖化酶及淀粉酶的酶活力為指標(biāo)，考察扇貝裙邊添加量0、30%、50%、70%、100%對制曲的影響，以確定兩種曲霉扇貝裙邊的最優(yōu)添加比例，結(jié)果如圖1、圖2所示。

由圖1可知，3種胞外水解酶活力都隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，并在75 h以后趨于平穩(wěn)。扇貝裙邊添加量為50%時，米曲霉中中性蛋白酶的活力最高，在75 h時達(dá)到最大875 U/g，與不添加扇貝裙邊的酶活力相當(dāng)（905 U/g）；從糖化酶與淀粉酶活力看，扇貝裙邊的添加比例越高，酶活力越高，均在添加比例100%時，二者酶活力最高，分別達(dá)到676 U/g和42 U/g，比0%添加時高出3.07和3.12倍。由于醬油制備中，需要強(qiáng)化蛋白的水解，因此蛋白酶活力是關(guān)鍵，且在制曲過程中發(fā)現(xiàn)，隨著扇貝裙邊添加量的增加，米曲孢子繁殖嚴(yán)重，有不良?xì)馕懂a(chǎn)生，不適宜上罐發(fā)酵。因此，綜合考慮3種酶活力和菌絲生長狀況，確定50%的扇貝裙邊添加為最佳比例，即米曲霉As3.042菌種的制曲原料質(zhì)量比為豆粕∶扇貝裙邊∶粗麥粉∶水=25∶25∶33∶38，培養(yǎng)時長為75 h。

從圖2可知，與米曲霉相似，扇貝裙邊添加比例為50%時黑曲霉中酸性蛋白酶的酶活力最高，達(dá)到6 001 U/g，比0%添加時高出1.48倍；同時，扇貝裙邊的添加有利于糖化酶和淀粉酶酶活力的提高，二者的最高值均出現(xiàn)在100%的添加組，酶活力分別達(dá)到4 594 U/g和77 U/g，比0%添加組高出2.45和1.53倍。但同樣，制曲過程中發(fā)現(xiàn)扇貝裙邊添加量過高，孢子繁殖嚴(yán)重，且產(chǎn)生不良?xì)馕?。因此綜合考慮，確定50%扇貝裙邊添加比例為最佳，即黑曲霉As3.350制曲最佳原料配比為豆粕∶扇貝裙邊∶粗麥粉∶水=25∶25∶33∶38，培養(yǎng)時長為69 h。

圖2 不同扇貝裙邊添加比例對黑曲霉AS3.350產(chǎn)酸性蛋白酶（A）、糖化酶（B）、淀粉酶（C）酶活力的影響Fig.2 Effect of different scallop skirt proportions on the activity of acid protease (A),saccharifying enzyme (B) and amylase (C) produced by Aspergillus niger AS3.350

2.2 高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

分別以氨基酸態(tài)氮、總氮、氨基多糖、?；撬?、可溶性無機(jī)鹽、總酸含量為評價指標(biāo)，考察最佳成曲復(fù)配比例與發(fā)酵時間，結(jié)果如圖3～圖8所示。從發(fā)酵時間看，兩種曲霉配比的醬油中氨基酸態(tài)氮、總氮、氨基多糖、?；撬岬暮侩S著發(fā)酵時間的延長而提高，在發(fā)酵時間160 d時達(dá)到最大，隨后指標(biāo)開始下降，故高鹽稀態(tài)的發(fā)酵時間確定為160 d。

從兩種曲霉配比的數(shù)據(jù)分析看，米曲霉∶黑曲霉=1∶2時，兩種霉更好地發(fā)揮協(xié)同作用，醬油中氨基酸態(tài)氮、總氮、氨基多糖、?；撬岬暮棵黠@高于米曲霉與黑曲霉復(fù)配比為1∶1時的產(chǎn)品指標(biāo)，分別高出后者11.5%、10.1%、11.2%、11.6%。以氨基酸態(tài)氮為例，前者在發(fā)酵160 d時含量最高可達(dá)0.79 g/100 mL，比米曲霉∶黑曲霉=1∶1的添加比例組高出11.5%，二者在發(fā)酵前160 d，氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率很高，160 d后含量有下降趨勢，醬醪中伴隨酵母菌的生長繁殖，蛋白酶的最適作用條件發(fā)生改變，蛋白質(zhì)水解速率變慢；詹春陽等[23]的研究曾指出，在米曲霉所產(chǎn)酶系當(dāng)中偏酸性蛋白酶相對較少，而醬油發(fā)酵是在偏酸性環(huán)境中進(jìn)行，在制曲過程中偏酸性蛋白酶酶活力越高，醬醪發(fā)酵成熟的越快，而黑曲霉具有很強(qiáng)的產(chǎn)酸性蛋白酶的能力，可以彌補(bǔ)米曲霉酶系酸性蛋白酶活力不高的缺陷，米曲霉∶黑曲霉=1∶2蛋白酶活力高，物料分解較完全；可溶性無機(jī)鹽含量雖然后者更優(yōu)，但兩種添加比例組無顯著差異，在160 d時二者均達(dá)到一級醬油標(biāo)準(zhǔn)；總酸含量隨發(fā)酵時間的延長產(chǎn)生醇類物質(zhì)而降低，已有文獻(xiàn)報道指出[24]，酸類化合物是酯化反應(yīng)的前提物質(zhì)，乙酸乙酯是醬油中最常見的酯類物質(zhì)，使香氣揮發(fā)，風(fēng)味提高，在發(fā)酵至160 d時，兩種復(fù)配比例條件下醬油的總酸含量相當(dāng)，均降至約2.5 g/100 mL。故而本研究綜合考慮上述測定的醬油的品質(zhì)指標(biāo)，確定米曲霉∶黑曲霉=1∶2的接種比例為最佳復(fù)配比。

圖3 米曲霉AS3.042及黑曲霉As3.350不同復(fù)配比例對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger As3.350 proportions on ammonia nitrogen content

圖4 米曲霉AS3.042及黑曲霉AS3.350不同復(fù)配比例對總氮含量的影響Fig.4 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger AS3.350 proportions on total nitrogen content

圖5 米曲霉AS3.042及黑曲霉AS3.350不同復(fù)配比例對氨基多糖含量的影響Fig.5 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger AS3.350 proportions on aminopolysaccharide content

圖6 米曲霉AS3.042及黑曲霉AS3.350不同復(fù)配比例對牛磺酸含量的影響Fig.6 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger AS3.350 proportions on taurine content

圖7 米曲霉AS3.042及黑曲霉AS3.350不同復(fù)配比例對可溶性無鹽固形物含量的影響Fig.7 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger AS3.350 proportions on soluble salt-free solid content

圖8 米曲霉AS3.042及黑曲霉AS3.350不同復(fù)配比例對總酸含量的影響Fig.8 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger AS3.350 proportions on total acid content

2.3 海鮮醬油品質(zhì)評價與對比分析

為進(jìn)一步評價采用優(yōu)化的高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝制備的海鮮醬油的品質(zhì)，將檢測指標(biāo)分別與國家標(biāo)準(zhǔn)和市售海鮮醬油的指標(biāo)作對比分析，以便尋找差距與不足，便于后期工藝的進(jìn)一步優(yōu)化。

經(jīng)高鹽稀態(tài)發(fā)酵法釀造而成的海鮮醬油，色澤鮮艷呈紅褐色，在發(fā)酵后期加入酵母菌，產(chǎn)生濃郁的酯香氣味[24]，味道便鮮、咸，甜味適口，感官評價所制備的扇貝裙邊高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油均達(dá)到國標(biāo)一級醬油的標(biāo)準(zhǔn)[25]。具體指標(biāo)分析結(jié)果如表3所示。

表3 兩種高鹽稀態(tài)海鮮醬油指標(biāo)檢測結(jié)果Table 3 Determination results of indexes of two kinds of seafood soy sauce by high salt-dilut fermentation

由表3可知，與國標(biāo)GB 18186—2000《釀造醬油》一級醬油相比，扇貝裙邊海鮮醬油中的質(zhì)量指標(biāo)皆高于國家標(biāo)準(zhǔn)，其中總氮含量和氨基酸態(tài)氮含量分別為1.60 g/100 mL、0.79 g/100 mL，均高于國標(biāo)要求；并且含有普通一級醬油所沒有的?；撬?、氨基多糖等功能性成分，在抗氧化、抗腫瘤等方面顯示出很好的優(yōu)勢。與市售高端海鮮特級醬油相比，氨基酸態(tài)氮含量低38.7%，但?；撬岷桶被嗵呛拷咏?，分析原因，一方面與市售醬油作為成品醬油有后期調(diào)制的因素，另一方面也說明本工藝仍需在增加中性和酸性蛋白酶活性方面進(jìn)一步改進(jìn)、提高，不斷優(yōu)化。

3 結(jié)論

本研究從扇貝加工過程中的副產(chǎn)物扇貝裙邊的高值化利用視角，以高品質(zhì)海鮮醬油發(fā)酵制備為目標(biāo)，在發(fā)酵用曲霉培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，在確定扇貝裙邊取代豆粕的最佳添加比例為50%，米曲霉As3.042和黑曲霉As3.350的制曲配料為豆粕∶扇貝裙邊∶粗麥粉∶水=25∶25∶33∶38（g∶g），培養(yǎng)時間分別為75 h和69 h的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝的工藝條件，確定了最佳的發(fā)酵時間為160 d，最佳的米曲與黑曲復(fù)配比例為1∶2，發(fā)酵溫度前30 d為15 ℃，后150 d為30 ℃，其總氮和氨基酸態(tài)氮的含量為1.6 g/100 mL、0.79 g/100 mL，均高于國標(biāo)要求，且含有普通一級醬油所沒有的?；撬?、氨基多糖等功能性成分，彌補(bǔ)傳統(tǒng)醬油缺陷，在色香味、生理功能等方面顯示出很好的優(yōu)勢。通過高鹽稀態(tài)發(fā)酵法將低價值的扇貝裙邊轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)價值高、海鮮風(fēng)味濃郁的海鮮醬油，實(shí)現(xiàn)了低值資源的高值化利用，一定程度上對于豐富我國高端海鮮調(diào)味品市場有重要的意義，未來發(fā)展市場潛力可觀。