周巧麗，付 強，王 琪，胡夢琪，金 岳，趙豐麗，2*

（1.廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006；2.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541006）

糖尿病已經(jīng)成為嚴重危害人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟最新數(shù)據(jù)顯示，目前有4.63億成年人患有糖尿病[1]，2019年有420萬名20～79歲的成年人死于糖尿病[2]。全球糖尿病的直接健康支出為7 600億美元，其中中國的糖尿病年度健康支出為1 090億美元[3]。糖尿病及其并發(fā)癥對個人、家庭以及國民經(jīng)濟具有重大的影響。因此，有效地預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥至關(guān)重要[4]。

α-葡萄糖苷酶抑制劑（α-glucosidase inhibition，α-GI）通過抑制α-葡萄糖苷酶，可有效地延緩腸道碳水化合物的消化吸收以維持餐后血糖正常，已廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療[5]。目前臨床上該類藥品有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等，在國內(nèi)外均具有可觀的市場銷量[6]，但存在藥物種類少、價格高、胃腸道反應(yīng)大、不良反應(yīng)發(fā)生率高等問題[7-8]。因此，開發(fā)安全高效的新型α-GI具有廣泛的前景[9-10]。

羅漢果具有降糖作用[11-12]，基于共生理論，其內(nèi)生菌可能也會產(chǎn)生降糖類物質(zhì)[13]。龍楚媚等[14-15]從羅漢果內(nèi)生菌中篩選出產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑的菌株，羅漢果內(nèi)生菌作為降糖活性物質(zhì)篩選來源尚有待探究。本研究從羅漢果內(nèi)生菌中篩選出產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的菌株，對其進行形態(tài)學觀察及分子生物學鑒定，采用單因素試驗及正交試驗優(yōu)化菌株發(fā)酵條件，并對其活性部位進行追蹤，以期為羅漢果內(nèi)生菌來源的α-GI的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

羅漢果內(nèi)生菌株：廣西師范大學發(fā)酵工程實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑

α-葡萄糖苷酶（酶活50 U/mg）、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）（純度99%）：上海源葉生物科技有限公司；阿卡波糖：杭州中美華東制藥有限公司；葡萄糖、氯化鈉、碳酸鈉（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：取去皮土豆200 g，切塊煮沸30 min，八層紗布過濾，加入20 g葡萄糖，定容至1 L，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：同發(fā)酵培養(yǎng)基，另加20 g瓊脂，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YM75型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；ZD-85型恒溫振蕩器：國華儀器制造有限公司；HP400S型生化培養(yǎng)箱：武漢瑞華儀器設(shè)備有限責任公司；BX63型熒光成像分析系統(tǒng)顯微鏡：日本Olympus公司；Infinite M200Pro酶標儀：帝肯貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與發(fā)酵培養(yǎng)

取36株保藏的羅漢果內(nèi)生菌株，分別劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃靜置培養(yǎng)3 d。挑取單菌落一環(huán)接種于裝100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于28℃、160 r/min搖床培養(yǎng)3 d，按1%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d，得發(fā)酵液用于目的菌株的篩選。

1.3.2α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選

采用對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）法進行篩選，參照LIMA R A T等[16-17]的方法具體如下：在96孔酶標板上，樣品組（發(fā)酵原液）依次加入50 μL樣液和100 μL的α-葡萄糖苷酶溶液（0.125 U/mL），37℃保溫10 min，加入50μL的PNPG（5 mmol/L）混勻，37 ℃反應(yīng)20 min，最后加入50 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液中止反應(yīng)，酶標儀（檢測波長405 nm）測其吸光度值。1 μg/mL的阿卡波糖溶液作陽性對照組，樣品空白組中用相同體積的磷酸緩沖液代替酶液，其余與樣品組相同。對照組中不加發(fā)酵液，用磷酸緩沖液補齊。對照空白組中不加酶液，其余與對照組相同，用磷酸緩沖液補齊。樣品對α-葡萄糖苷酶抑制率的計算公式如下：

式中：A樣品為樣品組的吸光度值；A樣品空白為樣品空白組的吸光度值；A對照為對照組的吸光度值；A對照空白為對照空白組的吸光度值。

1.3.3 菌株鑒定

形態(tài)觀察：采用平板劃線分離法將所篩目的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d，觀察菌落形態(tài)，初步確認為細菌后進行革蘭氏染色和芽孢染色[18]觀察。

分子生物學鑒定：由武漢華大基因科技有限公司對菌株進行16S核糖體RNA基因（16S ribosomal DNA，16S rDNA）測序，使用基于局部比對算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫已知序列進行比對，并利用MEGA7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 目的菌株搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素試驗：設(shè)置基本發(fā)酵條件為pH自然，按1%的接種量將目的菌株的種子液接入裝液量為100 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d。以此為基礎(chǔ)，調(diào)整各因素水平，研究不同pH值、裝液量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度以及接種量對產(chǎn)酶抑制劑的影響，其因素與水平見表1。

表1 單因素試驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of single factor tests

正交試驗：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對試驗結(jié)果影響大的因素進行正交試驗設(shè)計。

1.3.5 目的菌株活性部位的追蹤

取目的菌株發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，得上清液（胞外物）和沉淀，沉淀進一步用磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）沖洗3次，超聲波破碎細胞，破碎液于4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，得上清液即為菌體胞內(nèi)物[19]，分別測定胞內(nèi)物和胞外物對α-葡萄糖苷酶的抑制率，初步得到活性部位。

將所得目的菌株的1 L胞外物濃縮至500 mL，依次使用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇4種有機溶劑分別等體積萃取3次，萃取液合并后減壓濃縮得到各相浸膏。將浸膏配制成1 mg/mL的待測液，采用PNPG法檢測各萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制活性[20]，以質(zhì)量濃度為1 μg/mL的阿卡波糖溶液作為陽性對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)α-GI內(nèi)生菌株的篩選

采用PNPG法對產(chǎn)α-GI的內(nèi)生菌株進行篩選，結(jié)果見表2。由表2可知，得到8株內(nèi)生菌其發(fā)酵原液的抑制率在20%以上，其余菌株的抑制率均在20%以下，結(jié)果省略。在8株菌株中，菌株P(guān)D-14的發(fā)酵原液對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高達到60.70%，雖比陽性對照阿卡波糖（98.67%）的低，但仍顯示出較高的活性。因此，選擇菌株P(guān)D-14進行進一步鑒定。

表2 α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌篩選結(jié)果Table 2 Screening results of α-glucosidase inhibitor-producing strains

2.2 菌株P(guān)D-14的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

由圖1A可知，菌株P(guān)D-14在PDA培養(yǎng)基上生長良好，37 ℃培養(yǎng)15 h就可以形成明顯的菌落，菌落呈圓形、不透明、濕潤、表面光滑凸起。由圖1B可知，經(jīng)革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢，菌株P(guān)D-14為革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀。由圖1C可知，菌株P(guān)D-14有芽孢且位于菌體中間，芽孢呈橢圓形。根據(jù)菌株形態(tài)學觀察結(jié)果，初步鑒定該菌株屬于芽孢桿菌（Bacillus）。

圖1 菌株P(guān)D-14的菌落形態(tài)（A）、革蘭氏染色（B）及芽孢染色圖（C）Fig.1 Colony morphology (A),gram staining (B) and spore staining (C)of strain PD-14

2.2.2 分子生物學鑒定

由武漢華大基因科技有限公司測得菌株P(guān)D-14的16SrDNA基因序列堿基長度為1 465 bp。根據(jù)16SrDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，菌株P(guān)D-14與Bacillus velezensis同屬一個分支，與已知菌株Bacillus velezensisLZLJ01的同源性達到100%。結(jié)合菌株P(guān)D-14的形態(tài)觀察結(jié)果和分子生物學鑒定結(jié)果，確定菌株P(guān)D-14為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖2 菌株P(guān)D-14基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain PD-14 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

由表3可知，隨著pH值、裝液量、發(fā)酵溫度、接種量的升高，抑制率均先升后降，分別在初始pH值為7，裝液量為125 mL/250 mL，發(fā)酵溫度為30 ℃，接種量為5%時，發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高。隨著發(fā)酵時間的增加α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸增高，到第3天后趨于平穩(wěn)，因此選擇最優(yōu)發(fā)酵時間為3 d。在上述各因素最佳發(fā)酵條件下，α-葡萄糖苷酶抑制率在61.00%～87.85%。

表3 菌株P(guān)D-14發(fā)酵條件優(yōu)化的單因素試驗結(jié)果Table 3 Results of single factor tests for strain PD-14 fermentation conditions optimization

2.4 菌株P(guān)D-14發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

以單因素試驗為依據(jù)，固定初始pH值為7，選取裝液量（A）、發(fā)酵時間（B）、發(fā)酵溫度（C）和接種量（D）4個影響因素，以各因素對α-葡萄糖苷酶的抑制率為評價指標，采用L9（34）正交設(shè)計研究不同因素對菌株產(chǎn)α-GI的影響，正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析如表4所示，方差分析見表5。

表4 菌株P(guān)D-14發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for strain PD-14 fermentation conditions optimization

表5 正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal tests results

由表4可知，4個因素對菌株P(guān)D-14產(chǎn)α-GI的影響不同，根據(jù)極差大小，各因素影響強弱排序為A＞B＞C＞D，即裝液量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞接種量，其產(chǎn)α-GI最佳發(fā)酵條件組合為A1B3C2D3，即裝液量100 mL/250 mL、發(fā)酵時間4 d、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量7%。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，α-葡萄糖苷酶的抑制率為91.05%，與陽性對照1 μg/mL阿卡波糖溶液的抑制率98.67%接近。由表5可知，因素A（裝液量）對結(jié)果影響達到極顯著水平（P＜0.01），而發(fā)酵時間、溫度和接種量對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.5 目的菌株活性部位追蹤結(jié)果

按照1.3.5方法追蹤活性部位，測定菌株P(guān)D-14胞內(nèi)胞外物以及發(fā)酵液各萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制率的影響。結(jié)果表明，菌株P(guān)D-14的胞內(nèi)物對α-葡萄糖苷酶的抑制率較低，而胞外上清液的抑制率達到60.70%，說明α-GI主要集中在胞外即發(fā)酵液中。菌株P(guān)D-14發(fā)酵液中抑制α-葡萄糖苷酶的有效相為正丁醇相和水相，抑制率分別為77.60%和76.70%（質(zhì)量濃度為1 mg/mL），陽性對照組的抑制率為95.01%（質(zhì)量濃度為1 μg/mL）。

3 結(jié)論

從羅漢果內(nèi)生菌中篩選出一株高產(chǎn)α-GI的菌株P(guān)D-14，經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化得到該菌株產(chǎn)α-GI的最佳發(fā)酵條件為初始pH值為7，裝液量100 mL/250 mL，發(fā)酵時間4 d，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量7%。此優(yōu)化條件下，其發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到91.05%，是優(yōu)化前的1.5倍。發(fā)酵液經(jīng)萃取后，正丁醇相和水相對α-葡萄糖苷酶的抑制率較高，分別為77.61%和76.70%。