胡 琴，曹新志*，張楷正，鐘利明

（四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）即苦蕎麥，學(xué)名韃靼蕎麥，屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrium）一年生草本雙子葉植物，是一種食藥兩用的優(yōu)質(zhì)糧源[1-2]。其味略苦，具有耐旱、耐寒、耐酸、耐瘠、適應(yīng)性強及生長期短等特點，在全世界各地都有生產(chǎn)和消費[3-4]。蕎麥的種植歷史悠久，主要分為苦蕎和甜蕎兩大類[5]。苦蕎在我國已有2 000多年的栽種歷史，起源自喜馬拉雅山系東側(cè)及我國西南地區(qū)，現(xiàn)廣泛栽培于我國西南地區(qū)，是世界苦蕎的集中產(chǎn)地，常年播種面積在53萬hm2以上[6-7]。據(jù)《本草綱目》記載：“苦蕎味苦、性平寒，能實腸胃、益氣力、緩精神、利耳目、降氣、寬腸、健胃的作用”。黃酮類化合物是苦蕎中最為重要的生物活性成分[8]，具有抗病毒、清除自由基、延緩衰老、抑菌殺菌等功效[9]?？嗍w淀粉含量高于其他糧食作物，且支鏈淀粉含量豐富，是用于發(fā)酵釀造的理想原料[10]?？嗍w麥作為一種重要的農(nóng)作物，為充分利用苦蕎資源，提高原料利用率，具有極高的開發(fā)價值與廣闊的開發(fā)前景。

近年來，苦蕎因其具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能[10]，得到眾多專家學(xué)者的青睞。在食品方面，苦蕎被用來制作苦蕎饅頭、苦蕎醋和苦蕎茶等[11-14]。但是把苦蕎作為釀酒原料來研究的國家并不多，我國就是其中之一。如徐漢卿等[15-16]對苦蕎米酒的發(fā)酵工藝進行探究，以苦蕎和糯米為主要原料，釀得的苦蕎米酒營養(yǎng)豐富、口感醇厚，風(fēng)味獨特，是一種符合現(xiàn)代人健康理念的飲品；周火玲等[7]以大曲和小曲為糖化發(fā)酵劑，入池時以荷葉墊池底，入池后使用苦蕎黃酒淋醅，建立了一種苦蕎白酒的釀造新工藝，以此法釀制的苦蕎酒，出酒率提高了7.7%，總酸、總酯含量提高了50%以上，有獨特的營養(yǎng)價植及絕佳的口感。

本研究以苦蕎為原料，小曲為糖化發(fā)酵劑，采用半固態(tài)發(fā)酵方法[17]，從不同小曲添加量、培菌糖化溫度及培菌糖化時間對苦蕎小曲酒培菌糖化工藝進行研究，確定其最優(yōu)工藝條件，通過分析半固態(tài)發(fā)酵法苦蕎小曲酒的理化指標(biāo)、感官品評與揮發(fā)性風(fēng)味成分，為后續(xù)苦蕎小曲酒的工藝優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎：四川省涼山彝族自治州；小曲：重慶市合川區(qū)鑫星曲藥廠；酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅、氫氧化鈉、葡萄糖、亞鐵氰化鉀、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；MB25水分分析儀：奧豪斯儀器（上海）有限公司制造；DL-1電子萬用爐：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；GZ-250-S生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；AR1140電子天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；Thermo 868 pH計：熱電（上海）科技儀器有限公司；TSQ8000氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）儀：美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦蕎小曲酒工藝流程及操作要點

苦蕎→浸泡→蒸糧→攤涼→拌入小曲→培菌糖化→加水發(fā)酵→蒸餾→苦蕎小曲酒

操作要點：

浸泡：苦蕎常溫水浸泡4 h，料水比1∶3（g∶mL），要求浸后苦蕎手捏易碎，無硬芯；

蒸糧：將浸泡好的苦蕎瀝去水分，于常壓下蒸煮1.5 h至苦蕎開小口；

攤涼：將蒸好的苦蕎取出后適當(dāng)加水并迅速翻糧快速降溫，攤冷至品溫40 ℃左右開始下曲；

拌小曲：小曲添加量按0.6%拌入，分3次加入小曲（三次加量盡量一致）；

培菌糖化：攤涼、拌曲和上箱在2 h內(nèi)完成，防止雜菌感染，以免影響培菌，在糖化溫度30 ℃條件下糖化25 h；

加水發(fā)酵：按料水比1∶2（g∶mL）加水發(fā)酵，于28 ℃恒溫發(fā)酵7 d，發(fā)酵必須密封但要保證發(fā)酵氣體能排出；

蒸餾：半固態(tài)發(fā)酵的酒醅采用液態(tài)蒸餾法，得到苦蕎小曲酒。

1.3.2 培菌糖化工藝優(yōu)化單因素試驗

小曲添加量：分別稱取500 g苦蕎，按照1.3.1的工藝對苦蕎進行泡糧蒸糧后，分別添加0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的小曲，在30 ℃條件下恒溫糖化24 h，測定其還原糖含量和淀粉含量。

在此基礎(chǔ)上，依次考察糖化時間（20 h、22 h、24 h、26 h、28 h）、糖化溫度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃）對還原糖和淀粉含量的影響。

1.3.3 糖化工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以還原糖含量為評價指標(biāo)，采用正交試驗對小曲添加量（A）、糖化時間（B）和糖化溫度（C）進行優(yōu)化，確定苦蕎小曲酒的最佳培菌糖化條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 糖化工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for saccharification process optimization

1.3.4 理化指標(biāo)測定[18-19]

還原糖、淀粉、固形物含量的測定：參照《釀酒分析與檢測》；酒精度的測定：參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中的酒精計法；總酸、總酯的測定：參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法中的總酸、總酯測定》中的指示劑法。

1.3.5 原料出酒率的計算

1.3.6 感官評定[20]

感官評價由有專業(yè)經(jīng)驗的白酒品評人員對試驗所得的原酒進行感官評定，感官評定按照食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)DBS52/005—2014《小曲清香型白酒》中的方法進行，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2，滿分100分。

表2 苦蕎小曲酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

1.3.7 苦蕎小曲酒揮發(fā)性風(fēng)味成分分析[21]

苦蕎小曲酒中揮發(fā)性風(fēng)味成分測定采用GC-MS法。

氣相色譜（GC）條件：TG-WaxMS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He），流速1.0 mL/min；進樣量1 μL，分流比30∶1；程序升溫：初始柱溫40 ℃，保留3 min，以5 ℃/min升至70 ℃，保留0 min，再以8 ℃/min升至180 ℃，保留0 min，再以20 ℃/min升至250 ℃，保留5 min。

質(zhì)譜（MS）條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子化電子能量70 eV；采集模式為全掃描；接口溫度230 ℃；離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度260 ℃，質(zhì)量范圍30～550 amu。

定性定量方法：將經(jīng)過分析得到的總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖核對，對各揮發(fā)性成分進行定性，按峰面積歸一化法計算各風(fēng)味成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖化工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 小曲添加量的確定

在泡糧與蒸糧工藝都相同的條件下，小曲接種量分別采用0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的條件下進行培菌糖化24 h，分別測定糧醅的還原糖與淀粉含量，結(jié)果見圖1。

圖1 不同小曲添加量對還原糖和淀粉含量的影響Fig.1 Effect of different Xiaoqu addition on reducing sugar and starch contents

由圖1可知，隨著小曲添加量在0.3%～1.5%范圍內(nèi)的增加，淀粉含量呈先下降，后上升的趨勢，在小曲接種量達(dá)到0.6%時淀粉含量達(dá)到最低，為10.59%，小曲添加量為1.2%與1.5%時差異性不明顯（P＞0.05），其余各組之間均存在顯著性差異（P＜0.05）；糧醅中還原糖含量呈先上升再下降的趨勢，在小曲接種量達(dá)到0.6%時還原糖含量達(dá)到最高，為10.99%，并且五組變量之間均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。李大和等[22]研究的川法小曲白酒用曲量一般為0.30%～0.55%，并且經(jīng)實踐生產(chǎn)證明隨著酒曲添加量增加，發(fā)酵過于猛烈，酒出現(xiàn)苦味。因此，確定最佳小曲添加量為0.6%。

2.1.2 糖化時間的確定

由圖2可知，隨著糖化時間在20～24 h范圍內(nèi)的的增加，還原糖含量呈明顯的上升趨勢且慢慢趨于平穩(wěn)，淀粉含量呈下降趨勢。培養(yǎng)到24 h時，還原糖含量為11.0%，若繼續(xù)培養(yǎng)，此時淀粉含量呈下降趨勢，但還原糖含量基本保持不變，其原因可能是淀粉酶活力增長緩慢甚至不增長，并且根霉、酵母等微生物的生長繁殖過多的消耗淀粉分解的還原糖[3]。而且培養(yǎng)時間過長容易出現(xiàn)老箱，還原糖含量高，發(fā)酵升溫快，對發(fā)酵不利。因此，確定最佳糖化時間為24 h。

圖2 不同糖化時間對還原糖和淀粉含量的影響Fig.2 Effect of different saccharification time on reducing sugar and starch contents

2.1.3 糖化溫度的確定

由圖3可知，不同的糖化溫度對還原糖含量的影響較大，糖化溫度在30 ℃時，還原糖含量最高，達(dá)到11.23%，此時淀粉含量最低，為10.68%。當(dāng)溫度＜30 ℃時，還原糖含量低，其原因可能是根霉生長緩慢，酶活力較低。當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃后，隨著溫度的升高，可能造成根霉和曲霉的繁殖速度加快，導(dǎo)致中心溫度升高，箱內(nèi)有悶氣，使得微生物的生長繁殖受到抑制同時使分解淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖的能力也降低，故在30 ℃后，淀粉含量上升，還原糖含量下降。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖3 不同糖化溫度對還原糖和淀粉含量的影響Fig.3 Effect of different saccharification temperature on reducing sugar and starch contents

2.2 糖化工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以還原糖含量為評價指標(biāo)，進行3因素3水平正交試驗設(shè)計，正交試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 糖化工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for saccharification process optimization

由表3可知，苦蕎小曲酒培菌糖化工藝對還原糖含量的影響因素主次順序為A＞C＞B，即小曲添加量＞糖化溫度＞糖化時間，得出A2B3C2為最優(yōu)組合，即小曲添加量0.6%，糖化時間25 h，糖化溫度30 ℃。在此最佳條件下進行3次平行驗證試驗，苦蕎小曲酒還原糖含量為11.33%。

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表4可知，小曲添加量對糖化過程中還原糖含量有顯著性的影響（P＜0.05），而糖化時間和糖化溫度對還原糖含量的影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 糖化過程中各指標(biāo)變化

由圖4可知，在正交試驗所得最佳工藝條件下糖化，即小曲添加量0.6%，糖化時間25 h，糖化溫度30 ℃。在培菌糖化過程中，淀粉含量整體呈下降趨勢，在18 h前下降比較明顯，然后就緩慢下降。主要原因是小曲中的主要成分是根霉，在苦蕎經(jīng)過蒸煮后淀粉糊化，然后加入小曲進行糖化，根霉菌吸收糊化了的淀粉為養(yǎng)料生長繁殖，在繁殖過程中又將淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖，所以淀粉含量呈逐漸減少的趨勢；還原糖含量在前12 h變化不明顯，在12 h后明顯增加，在25 h還原糖含量達(dá)到最大值，然后逐漸平穩(wěn)。在糖化前期主要是根霉菌和酵母菌的生長繁殖，到中期后才開始產(chǎn)生大量的還原糖，到了后期淀粉原料基本消耗完，所以還原糖含量在后期基本不再增加；溫度整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在后期有少許的下降。由于拌曲溫度范圍在36～37 ℃左右，所以前期溫度會從拌曲溫度慢慢降至糖化溫度，隨后微生物也開始生長繁殖同時釋放熱量，所以溫度在中期持續(xù)上升，到后期營養(yǎng)物質(zhì)耗盡微生物幾乎停止生長也就不再繼續(xù)釋放熱量，溫度就稍有下降。

圖4 糖化過程中溫度、還原糖含量和淀粉含量的變化Fig.4 Changes of temperature,reducing sugar contents and starch contents during saccharification process

2.4 苦蕎小曲酒理化指標(biāo)分析

在研究確定的最佳糖化工藝條件下進行小試試驗，取3批次發(fā)酵的基酒進行出酒率、總酸、揮發(fā)酸及總酯的測定，結(jié)果見表5。由表5可知，半固態(tài)苦蕎小曲酒酒精度為51.3%vol，平均出酒率為57.25%，總酸含量為0.536 g/L，總酯含量為1.95 g/L，感官評分為83分。釀出的苦蕎小曲酒清亮透明，具有乙酸乙酯為主體的復(fù)合香氣，伴有苦蕎米特有的清香，不暴辣、不沖鼻、入口綿柔醇和、香味較協(xié)調(diào)。符合小曲固態(tài)法白酒中各項指標(biāo)的要求[23]。

表5 苦蕎小曲酒品質(zhì)指標(biāo)分析結(jié)果Table 5 Analysis results of quality indexes of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

2.5 苦蕎小曲酒揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

由表6可知，利用GC-MS對半固態(tài)苦蕎小曲酒揮發(fā)性風(fēng)味成分進行檢測，其中揮發(fā)性物質(zhì)主要為有機酸、酯類、醇類、羰基化合物，其中酯類含量最多，且主要以乙酯的形式存在。半固態(tài)發(fā)酵法釀造苦蕎小曲酒共檢出31種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類14種，其中醇類9種，酸類3種，其他類5種。結(jié)果表明，酯類化合物是構(gòu)成小曲酒揮發(fā)性香氣的重要物質(zhì)，主要以乙酯的形式存在，它們賦予小曲酒水果香、花香的感官特征。醇類化合物中，除乙醇外含量較高的是異戊醇、異丁醇、苯乙醇、2-丁醇、正丙醇，其中異丁醇、正丙醇略有葡萄酒香，苯乙醇是玫瑰香味的典型代表。另外，異丁醇、異戊醇是雜醇油的主要成分，含量過高會使頭痛、頭暈等[24]。異丁醇、異戊醇等高級醇含量偏高是影響小曲酒酒質(zhì)的重要問題，雜醇油形成量及其各高級醇所占百分比例，可能與酵母菌株種類、發(fā)酵溫度等因素有關(guān)，有待進一步從發(fā)酵工藝上研究改進。

表6 苦蕎小曲酒揮發(fā)性風(fēng)味成分測定結(jié)果Table 6 Determination results of volatile flavor components of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

3 結(jié)論

本試驗以苦蕎為原料，以小曲為糖化發(fā)酵劑，采用半固態(tài)發(fā)酵法釀造苦蕎小曲酒，最優(yōu)糖化工藝為：小曲添加量0.6%，糖化時間為25 h，糖化溫度為30 ℃。在此條件下半固態(tài)發(fā)酵法釀造苦蕎小曲酒酒精度為51.3%vol、平均出酒率為57.25%、總酸含量為0.536 g/L、總酯含量為1.95 g/L，感官評分83分?？嗍w小曲酒揮發(fā)性成分共檢出31種，其中醇類9種，酸類3種，其他類5種。本研究僅僅對糖化工藝進行了優(yōu)化，后續(xù)還可以對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化及風(fēng)味物質(zhì)生成規(guī)律等進行研究，為半固態(tài)法苦蕎小曲酒的生產(chǎn)和研發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。