郭娟娟，李江洪，龍婷婷，莫 易，于靜澤，張 鵬，李勇昊*

（1.泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362000；2.重慶科技學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401331；3.福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 泉州 362000）

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是光合效率很高的單細(xì)胞真核綠藻，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，易于大規(guī)模培養(yǎng)；同時(shí)富含氨基酸、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪酸和色素等生物活性物質(zhì)[1]，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的新資源食品；此外被廣泛用于活性物質(zhì)提取、污水處理、生物柴油等領(lǐng)域[2-5]。因此建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，為實(shí)現(xiàn)代謝工程育種、利用合成生物學(xué)生產(chǎn)高附加值天然產(chǎn)物及為實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供有效技術(shù)支持[6-7]。

根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法由于具有更高的轉(zhuǎn)化效率和良好的轉(zhuǎn)基因微生物遺傳穩(wěn)定性被廣泛用于微藻的遺傳轉(zhuǎn)化[8]。侯善茹等[9]建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）的轉(zhuǎn)化方法，但是試驗(yàn)將共培養(yǎng)48 h后的微藻轉(zhuǎn)接篩選培養(yǎng)基，7 d后得到轉(zhuǎn)化子，總體轉(zhuǎn)化時(shí)間超過10 d。馮興標(biāo)等[10]建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)C.pyrenoidosa的遺傳轉(zhuǎn)化體系，培養(yǎng)11 d后得到陽性轉(zhuǎn)化子。CHENG Y等[11]利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法實(shí)現(xiàn)Schizochytriumsp.的遺傳轉(zhuǎn)化，在篩選平板上光照培養(yǎng)7 d后成功獲得轉(zhuǎn)化子。THYE S C等[12]采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法建立了小球藻的遺傳轉(zhuǎn)化，但是共培養(yǎng)時(shí)間耗時(shí)3 d，共培養(yǎng)結(jié)束轉(zhuǎn)到篩選平板需要7 d才能得到陽性轉(zhuǎn)化子。以上數(shù)據(jù)表明，微藻遺傳轉(zhuǎn)化體系基本成熟，但是利用生長(zhǎng)較慢的自養(yǎng)微藻細(xì)胞為受體會(huì)顯著延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間，同時(shí)具有易污染以及假陽性多等風(fēng)險(xiǎn)。

因此，利用可異養(yǎng)的C.pyrenoidosa為研究對(duì)象，探索根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)其遺傳轉(zhuǎn)化的可行性，并對(duì)主要參數(shù)包括農(nóng)桿菌濃度、乙酰丁香酮濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基pH以及共培養(yǎng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。建立短時(shí)高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)異養(yǎng)微藻遺傳轉(zhuǎn)化體系，并且為其他可異養(yǎng)微藻的高效遺傳轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）：中國科學(xué)院武漢水生生物所；根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL-1、GV3101和LBA4404感受態(tài)：上海唯地生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pCXSN：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：碧云天生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物合成和DNA序列測(cè)定由北京擎科生物科技有限公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（用于根瘤農(nóng)桿菌活化與培養(yǎng)）：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

BG11培養(yǎng)基（小球藻自養(yǎng)）：硝酸鈉1.5 g/L、三水磷酸氫二鉀0.04 g/L、碳酸鈉0.02 g/L、七水硫酸鎂75 mg/L、二水氯化鈣36 mg/L、檸檬酸6 mg/L、檸檬酸鐵銨6 mg/L、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）1 mg/L、硝酸2.86 mg/L、一水氯化錳1.81 mg/L、七水硫酸鋅0.222 mg/L、五水硫酸銅0.079 mg/L、二水鉬酸鈉0.39 mg/L、六水硝酸鈷0.049 mg/L；異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)加入葡萄糖20 g/L和酵母粉2 g/L。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基（induction medium，IM）：K2HP410 mmol/L、KH2PO410 mmol/L、NaCl 2.5 mmol/L、MgSO42 mmol/L、CaCl20.7 mmol/L、FeSO49 μmol/L、（NH4）2SO44 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、甘油0.5%、乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）200 μmol/L。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基（co-culture medium，CM）：即IM培養(yǎng)基加瓊脂20 g/L。

篩選培養(yǎng)基：在異養(yǎng)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加潮霉素B40μg/mL和頭孢霉素500 μg/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

iMark酶標(biāo)儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；ZWYR-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制備有限公司；5804R冷凍離心機(jī)：德國艾本德股份公司；LRH-150F生化培養(yǎng)箱、MGC-250BP-2L LED光源光照培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；A600梯度PCR儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

按說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌細(xì)胞，將含有質(zhì)粒pCXSN的A.tumefaciensAGL-1、GV3101和LBA4404分別劃線接種于含有相應(yīng)抗生素的平板上于28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單克隆菌株用于后續(xù)研究。C.pyrenoidosa劃線于異養(yǎng)培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)2 d。將單克隆藻株活化后按接種量5%分別接種到50 mL自養(yǎng)與異養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其中自養(yǎng)微藻置于28 ℃光照培養(yǎng)，異養(yǎng)微藻于28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)定OD517nm值，繪制生長(zhǎng)曲線[13]。

1.3.2 抗生素的敏感性檢測(cè)

100 μLC.pyrenoidosa分別涂布于含有不同濃度潮霉素B和頭孢霉素的異養(yǎng)培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)2 d。潮霉素B質(zhì)量濃度分別為0、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和40μg/mL；頭孢霉素質(zhì)量濃度分別為0、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400 μg/mL和500 μg/mL。

1.3.3 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)C.pyrenoidosa遺傳轉(zhuǎn)化

C.pyrenoidosa于28 ℃，異養(yǎng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，180 r/min離心去上清，無菌水稀釋至107個(gè)細(xì)胞/mL備用；活化的三種A.tumefaciens接種到IM培養(yǎng)基培養(yǎng)至一定濃度，取100 μL菌液與100 μLC.pyrenoidosa混勻，涂布于事先覆蓋滅菌玻璃紙的CM培養(yǎng)基，一定溫度條件下暗培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間，將玻璃紙轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)2 d挑取潛在的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化效率計(jì)算公式如下：

1.3.4 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別在IM培養(yǎng)基培養(yǎng)含有pCXSN質(zhì)粒的A.tumefaciensAGL-1、GV3101和LBA4404，使其OD600nm值分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，根據(jù)轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)/106微藻確定農(nóng)桿菌種類與濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。設(shè)置乙酰丁香酮濃度分別為0、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L和500 μmol/L；共培養(yǎng)溫度分別為20 ℃、22 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃和28 ℃；共培養(yǎng)時(shí)間分別為12 h、24 h、40 h、48 h、72 h和96 h；CM培養(yǎng)基pH分別為5.0、5.2、5.4、5.6、5.8和6.0。同上方法確定不同條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，均做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.3.5 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證及分析

篩選培養(yǎng)基隨機(jī)挑取單菌落，采用異養(yǎng)培養(yǎng)基28 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d后以菌液為模板，sF-pCXSN（TCATCGCAAGACCG-GCAACA）與sR-pCXSN（ACCTCGACCTCAACACAACA）為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。反應(yīng)體系（12.5 μL）：模板0.5 μL、兩個(gè)引物各0.5 μL、PlantTaqTMDNA聚合酶（2×）6.25 μL、雙蒸水（ddH2O）4.75 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45s，30次循環(huán)；72 ℃、5 min。PCR完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白核小球藻生長(zhǎng)曲線

自養(yǎng)與異養(yǎng)條件下蛋白核小球藻的生長(zhǎng)曲線見圖1。由圖1可知，異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，可迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，并在培養(yǎng)62 h后達(dá)到穩(wěn)定期且OD517nm值=8.127，然后逐漸下降；而自養(yǎng)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)速度顯著降低，由于接種量低導(dǎo)致在80 h依然處于遲緩期。說明分別以20 g/L葡萄糖和2 g/L酵母粉為碳氮源可在無光條件下實(shí)現(xiàn)C.pyrenoidosa的快速培養(yǎng)，且生長(zhǎng)速度為自養(yǎng)培養(yǎng)的3～5倍。

圖1 不同培養(yǎng)方式對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different cultivation methods on the growth of Chlorella pyrenoidosa

2.2 抗生素的敏感性檢測(cè)

由于篩選培養(yǎng)基添加潮霉素B篩選陽性轉(zhuǎn)化子，頭孢霉素抑制根瘤農(nóng)桿菌生長(zhǎng)；因此檢測(cè)兩種抗生素對(duì)C.pyrenoidosa的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度的潮霉素B對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different hygromycin B concentrations on the growth of Chlorella pyrenoidosa

由圖2可知，當(dāng)潮霉素B質(zhì)量濃度在10 μg/mL時(shí)對(duì)藻體的生長(zhǎng)無顯著影響，藻落生長(zhǎng)仍然比較旺盛，與對(duì)照組生長(zhǎng)情況無顯著差異；當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到20 μg/mL即對(duì)藻體生長(zhǎng)有極顯著的抑制作用（P＜0.01），但是其質(zhì)量濃度在20 μg/mL時(shí)培養(yǎng)基上仍然會(huì)有少量藻落生長(zhǎng)。當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到30 μg/mL及以上時(shí)會(huì)完全抑制藻體的生長(zhǎng)。因此，為篩選陽性轉(zhuǎn)化子且避免假陽性出現(xiàn)，試驗(yàn)確定以40 μg/mL潮霉素B作為篩選培養(yǎng)基的抗生素濃度。

頭孢霉素會(huì)抑制根瘤農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，但對(duì)C.pyrenoidosa的影響尚不清楚。不同濃度的頭孢霉素對(duì)C.pyrenoidosa生長(zhǎng)的影響結(jié)果見圖3。C.pyrenoidosa在加有不同濃度頭孢霉素的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況與不添加頭孢霉素的微藻生長(zhǎng)情況無顯著性差異，可確定頭孢霉素對(duì)C.pyrenoidosa生長(zhǎng)無抑制作用。因此，篩選培養(yǎng)基中可添加500 μg/mL頭孢霉素抑制根瘤農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，利于陽性C.pyrenoidosa的生長(zhǎng)與挑選。

圖3 不同質(zhì)量濃度的頭孢霉素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of different cephalosporin concentrations on the growth of Chlorella pyrenoidosa

2.3 農(nóng)桿菌種類及濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

農(nóng)桿菌種類及濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響見圖4。由圖4可知，A.tumefaciensGV3101和LBA4404在菌株濃度OD600nm值=0.2～1.0條件下，均可成功侵染C.pyrenoidosa獲得陽性轉(zhuǎn)化子。當(dāng)OD600nm值=0.6時(shí)，GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化率為53.84個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)微藻，LBA4404介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率為轉(zhuǎn)化子47.57個(gè)/106個(gè)微藻，而使用AGL-1獲得轉(zhuǎn)化效率僅為4.23個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)微藻，GV3101和LBA4404介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率分別是AGL-1的12.73倍和11.24倍；已有文獻(xiàn)報(bào)道不同根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)不同物種遺傳轉(zhuǎn)化具有不同的效率，且差異很大[14-15]，本試驗(yàn)說明根瘤農(nóng)桿菌AGL-1不宜用于介導(dǎo)C.pyrenoidosa的遺傳轉(zhuǎn)化。

進(jìn)一步檢測(cè)GV3101和LBA4404在不同菌濃下對(duì)介導(dǎo)C.pyrenoidosa轉(zhuǎn)化效率的影響。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率隨著LBA4404菌株濃度的提高而增加，當(dāng)OD600nm值=1.0時(shí)，轉(zhuǎn)化效率為60.12個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)微藻；而GV3101濃度OD600nm值=0.8時(shí)獲得最高的轉(zhuǎn)化效率，為64.01個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)微藻。說明兩種農(nóng)桿菌GV3101和LBA4404均可實(shí)現(xiàn)C.pyrenoidosa的異養(yǎng)轉(zhuǎn)化，且并無顯著性差異（P＞0.05），但是由于GV3101可以在更短的時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)到OD600nm值=0.8，因此選用菌株為農(nóng)桿菌GV310且OD600nm值=0.8進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 農(nóng)桿菌種類與濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 Effect of Agrobacterium species and concentration on transformation efficiency

2.4 優(yōu)化根瘤農(nóng)桿菌GV310介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法

對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖5。由圖5可知，AS濃度在200 μmol/L以下時(shí)轉(zhuǎn)化效率隨濃度的增加而提高，且AS濃度=400 μmol/L時(shí)也可獲得高轉(zhuǎn)化效率。但是考慮試驗(yàn)成本，選用AS濃度為200 μmol/L進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，然而本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)AS濃度為300 μmol/L時(shí)會(huì)降低小球藻轉(zhuǎn)化效率，原因可能是抑制了根瘤農(nóng)桿菌的活性以及小球藻的萌發(fā)。隨著A.tumefaciensGV3101與C.pyrenoidosa共培養(yǎng)溫度升高根瘤農(nóng)桿菌活性增強(qiáng)，有利于其侵染小球藻實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，而溫度過高后更利于根瘤農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)從而降低其侵染小球藻活性導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降，本研究表明當(dāng)共培養(yǎng)溫度為24 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)到85.33個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)微藻。本試驗(yàn)初期并未設(shè)置24 ℃共培養(yǎng)溫度，但試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)在25 ℃共培養(yǎng)條件下可看到農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，所以降低溫度抑制其生長(zhǎng)，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)化效率。在共培養(yǎng)時(shí)間＜40 h之前，隨著共培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)可以提高轉(zhuǎn)化效率，但超過40 h后繼續(xù)提高共培養(yǎng)時(shí)間會(huì)降低得到的轉(zhuǎn)化子數(shù)目，因此最佳共培養(yǎng)時(shí)間是40 h，因?yàn)橹挥斜ＷC足夠的共培養(yǎng)時(shí)間才能夠給予根瘤農(nóng)桿菌足夠的時(shí)間實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，但是過長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間會(huì)促進(jìn)GV3101生長(zhǎng)反而不利于轉(zhuǎn)化同時(shí)易使轉(zhuǎn)化子不易分辨，有報(bào)道小球藻轉(zhuǎn)化過程中共培養(yǎng)48 h轉(zhuǎn)化效率最高[12]，但是該研究使用的是自養(yǎng)小球藻，培養(yǎng)基不適宜農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，因此若利用異養(yǎng)微藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，需要降低共培養(yǎng)時(shí)間，完成轉(zhuǎn)化且保證農(nóng)桿菌不宜生長(zhǎng)。當(dāng)pH值為5.4時(shí)，得到最高的轉(zhuǎn)化效率為82.58個(gè)轉(zhuǎn)化子/106微藻。但當(dāng)pH值過高或過低時(shí)，轉(zhuǎn)化效率均會(huì)受到影響。通過優(yōu)化試驗(yàn)使轉(zhuǎn)化效率較優(yōu)化前提高了29%。

圖5 不同參數(shù)對(duì)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蛋白核小球藻遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 Effect of different parameters on Agrobacterium-mediated transformation efficiency of Chlorella pyrenoidosa

2.5 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證及分析

前期研究表明A.tumefaciensGV3101可成功實(shí)現(xiàn)異養(yǎng)培養(yǎng)C.pyrenoidosa的遺傳轉(zhuǎn)化，且在篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后即可出現(xiàn)單藻落，結(jié)果見圖6A。由圖6A可知，清晰可見深綠色的C.pyrenoidosa單藻落為潛在的陽性轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取10個(gè)單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖6B。由圖6B可知，在1 000 bp左右的有明顯特異性條帶，這與目的片段的理論大小942 bp相符合，說明外源DNA片段成功整合到C.pyrenoidosa基因組中。

圖6 蛋白核小球藻轉(zhuǎn)化子篩選平板（A）以及PCR驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子（B）Fig.6 Screening plate of pyrenoid Chlorella pyrenoidosa transformation(A) and confirmation of positive transformants via PCR (B)

對(duì)比目前已報(bào)道的不同方法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞綠藻遺傳轉(zhuǎn)化情況，結(jié)果見表1。由表1可知，與其他使用自養(yǎng)微藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化相比，本研究使用異養(yǎng)小球藻比現(xiàn)有報(bào)道普遍縮短了3～5倍得到陽性轉(zhuǎn)化子的時(shí)間。且由表1可知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具有最高的轉(zhuǎn)化效率，與本研究結(jié)果一致。因此本研究高效且快速的蛋白核小球藻遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立不僅為后續(xù)小球藻遺傳改造提供了技術(shù)手段，而且也為其他可異養(yǎng)微藻實(shí)現(xiàn)快速轉(zhuǎn)化提供科學(xué)依據(jù)。

表1 不同方法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞綠藻的遺傳轉(zhuǎn)化效率Table 1 Genetic transformation efficiency of the unicellular green alga with different approaches

3 結(jié)論

本研究嘗試建立異養(yǎng)微藻遺傳轉(zhuǎn)化體系，最終發(fā)現(xiàn)調(diào)整根瘤農(nóng)桿菌GV3101初始OD600nm值=0.8，小球藻濃度為107個(gè)/mL時(shí)，各取100 μL混合涂布在pH=5.4、乙酰丁香酮濃度為200 μmol/L的CM平板上，24 ℃避光培養(yǎng)40 h后轉(zhuǎn)到含有潮霉素B的篩選培養(yǎng)基，僅2 d轉(zhuǎn)化子便清晰可見，數(shù)目達(dá)88個(gè)轉(zhuǎn)化子/106微藻，轉(zhuǎn)化子通過傳代后菌液PCR鑒定均為陽性轉(zhuǎn)化子，陽性率達(dá)100%。利用異養(yǎng)微藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化不但可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)轉(zhuǎn)化時(shí)間比使用自養(yǎng)微藻為受體細(xì)胞普遍減少3～5倍，為后續(xù)小球藻代謝工程改造或者以小球藻為底盤微生物的合成生物學(xué)研究與應(yīng)用提供技術(shù)手段，并且為其它可異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的高效遺傳轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。