陳德奎， 郭 香， 鄭明揚(yáng)， 陳曉陽(yáng), 周 瑋， 張 慶

(廣東木本飼料工程技術(shù)研究中心， 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510642)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好且在世界范圍內(nèi)廣泛種植的一種適應(yīng)性良好的優(yōu)良的豆科牧草，享有“牧草之王”的美稱[1-2]。紫花苜蓿的粗蛋白質(zhì)(Crude protein,CP)含量豐富，優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿的蛋白質(zhì)含量可達(dá)18%以上[3]。除此之外，紫花苜蓿中還富含礦物質(zhì)元素[4]。青貯飼料是厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物，是有效保存牧草的方式之一，能夠有效克服外界環(huán)境對(duì)牧草營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞[1]。因此，對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行青貯保存是一種避免紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)損失的有效途徑。然而，由于紫花苜蓿的高緩沖性能和低干物質(zhì)(Dry matter,DM)含量，在青貯過(guò)程種紫花苜蓿青貯的pH通常維持在一個(gè)較高水平，無(wú)法抑制梭狀芽孢桿菌、芽孢桿菌和腸桿菌等不良微生物的生物活動(dòng)，從而造成紫花苜蓿青貯腐敗變質(zhì)[5]。因此，抑制紫花苜蓿青貯過(guò)程中的有害微生物的生長(zhǎng)和繁殖是提升青貯品質(zhì)的有效途徑。

植物精油是從植物根莖葉中提取的具有廣譜抗菌活性的具有芳香氣味的液體[6]。在食品加工中，植物精油常作為天然防腐劑來(lái)抑制致病菌的生長(zhǎng)從而延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期[7]。植物精油對(duì)致病性大腸桿菌(EscherichiacoliO157:H7)、金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(SalmonellaTyphimurium)等食源性致病菌的抑菌活性較強(qiáng)[8]。在動(dòng)物飼料中添加植物精油，有益于動(dòng)物健康的改善和生產(chǎn)性能的提高。在豬和家禽飼料中適當(dāng)添加植精油可以使其體重、飼料采食量和飼料轉(zhuǎn)化率得到改善，并且能夠提高畜禽的免疫能力[9]。有研究表明，在反芻動(dòng)物瘤胃中添加植物精油能夠有效改善瘤胃發(fā)酵內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)微生物菌群并提高青貯飼料利用率[10-12]。此外，植物精油對(duì)青貯中的不良微生物(酵母菌，梭狀芽孢桿菌，串珠鐮刀菌)也有著不錯(cuò)的抑制效果，并對(duì)嗜酸乳酸桿菌的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用[13]。然而，在青貯中添加植物精油的研究卻比較少。

砂仁(AmomumvillosumLour.)是中醫(yī)中常用的一味芳香性藥材，具有清熱解暑、行氣、消脹等保健功能[14]。砂仁精油(AmomumvillosumLour. essential oil,AVEO)主要成分為烯類、酯類和醇類，由于AVEO具有廣譜的抗菌活性，不僅可以作為抗菌藥物用于臨床，也可以作為天然防腐添加劑應(yīng)用于食品加工行業(yè)[15-16]。

因此，本研究旨在探索AVEO抑菌活性對(duì)紫花苜蓿青貯品質(zhì)以及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響，從而篩選出適宜的砂仁精油添加量，為豐富青貯添加劑資源庫(kù)提供理論支持，為砂仁精油在青貯領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

第2茬初花期紫花苜蓿原料刈割自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林北試驗(yàn)田。AVEO購(gòu)自陽(yáng)江市百盛實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將新鮮的紫花苜蓿原料用鍘刀切割成1～2 cm，并攪拌均勻。分別將等量的0.5% AVEO，1% AVEO和蒸餾水均勻噴灑在原料上，蒸餾水處理的設(shè)為對(duì)照組(CK)。然后將處理后的原料混合均勻后裝到聚乙烯密封袋(20 cm×30 cm)中，每袋大概100 g，并用真空密封機(jī)抽出密封袋中的空氣并密封。將密封好的青貯飼料放置在室內(nèi)(27～30℃)保存。在15 d和30 d開(kāi)袋取樣并對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)及化學(xué)成分進(jìn)行分析。試驗(yàn)一共設(shè)計(jì)3個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，一共18袋。分兩次開(kāi)袋，每次每個(gè)處理取3個(gè)重復(fù)。

1.3 青貯品質(zhì)及微生物群落分析

1.3.1發(fā)酵品質(zhì)分析 開(kāi)袋后，隨機(jī)取10 g青貯樣品，并加入90 mL無(wú)菌蒸餾水均勻混合，在—4℃的冰箱中冷凍保存18 h。隨后用4層紗布和中速定性濾紙過(guò)濾，濾液用于測(cè)量pH、有機(jī)酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)和氨態(tài)氮(Ammonia nitrogen,NH3-N)含量。用pH計(jì)(PHS-3C，上海雷磁)測(cè)定樣品的pH值。用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定NH3-N的含量[17]。按照He等[18]試驗(yàn)方法，使用高效液相色譜儀測(cè)定有機(jī)酸的含量。

1.3.2微生物數(shù)量測(cè)定 另取10 g青貯樣品，與90 mL無(wú)菌生理鹽水(0.85% NaCl)均勻混合，并用4層紗布過(guò)濾，取濾液。將濾液從10-1～10-6逐級(jí)稀釋。乳酸菌和大腸桿菌分別接種在MRS瓊脂培養(yǎng)基(環(huán)凱生物科技有限公司，廣州)和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基(VRBA；環(huán)凱生物科技有限公司，廣州)中，并在30℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。酵母菌和霉菌接種在孟加拉(虎紅)紅培養(yǎng)基(環(huán)凱生物科技有限公司，廣州)中，并在28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定微生物數(shù)量，并將微生物數(shù)量轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)g表示。

1.3.3營(yíng)養(yǎng)成分分析 將剩下的約80 g青貯樣品稱重后，放置在65℃的烘箱中干燥48 h除去水分，測(cè)定DM含量。然后將烘干的樣品粉碎并過(guò)1 mm篩，粉樣用于測(cè)定CP和真蛋白(True protein,TP)。采用全自動(dòng)凱氏定氮儀(Kjeltec 8400,FOSS,丹麥)分析CP。按照Licitra等[19]人的方法測(cè)定TP的含量。非蛋白氮(Non-protein nitrogen,NPN)的含量計(jì)算如下：

WNPN=WCP- WTP

除此之外，用A220纖維分析儀(ANKOM科技公司，美國(guó)紐約州馬其頓)測(cè)量中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)的含量。用硫酸-蒽酮比色法測(cè)定水溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates,WSC)的濃度[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0中雙因素方差分析(Two-way AVOVA)對(duì)紫花苜蓿發(fā)酵參數(shù)和蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)進(jìn)行了分析。顯著性差異采用Duncan多重極差檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，表示為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿原料的特性

如表1所示，紫花苜蓿原料中DM含量為299 g·kg-1FM，CP含量為141 g·kg-1DM。DM中纖維含量占比較大，NDF含量為467 g·kg-1DM，ADF含量為341 g·kg-1DM；WSC濃度較低，濃度為33.2 g·kg-1DM。外附微生物較豐富，乳酸菌數(shù)量為6.68 lg cfu·g-1FM，大腸桿菌數(shù)量為6.25 lg cfu·g-1FM，酵母菌和霉菌數(shù)量分別為5.06 lg cfu·g-1FM和4.37 lg cfu·g-1FM。

表1 紫花苜蓿原料的營(yíng)養(yǎng)成分及微生物群落數(shù)量

2.2 紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)分析

AVEO對(duì)紫花苜蓿發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量的影響如表2所示。在青貯第30 d，添加0.5% AVEO和1% AVEO均顯著提高了紫花苜蓿青貯的DM含量(P<0.01)；與DM含量提高一致的是，添加0.5% AVEO和1% AVEO也使紫花苜蓿的干物質(zhì)回收率顯著提高(P<0.01)。在AVEO的作用下，紫花苜蓿青貯的pH值顯著降低(P<0.01)。青貯時(shí)間的延長(zhǎng)也顯著降低了pH值(P<0.05)。同時(shí)在0.5% AVEO和1% AVEO處理中，青貯時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低了乳酸菌的數(shù)量(P<0.05)。在青貯第15 d，1% AVEO顯著降低了大腸桿菌的數(shù)量(P<0.05)，隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)大腸桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.01)。AVEO與青貯時(shí)間的交互作用對(duì)紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物組分無(wú)顯著影響。隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)乳酸的積累量顯著增多(P<0.05)。在青貯的第30 d，用1% AVEO精油處理的紫花苜蓿青貯乳酸含量顯著增多(P<0.05)。與乳酸增加相似的是，乙酸的含量也隨著青貯時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)。

表2 AVEO對(duì)紫花苜蓿發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量的影響

2.3 紫花苜蓿青貯營(yíng)養(yǎng)成分分析

紫花苜蓿青貯蛋白質(zhì)組分分析結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，時(shí)間和AVEO處理對(duì)紫花苜蓿的粗蛋白含量均無(wú)顯著影響。與CK相比，添加0.5% AVEO在青貯第30 d提高了TP的含量，1% AVEO在青貯第15 d和第30 d均顯著提高了紫花苜蓿青貯的TP含量(P<0.05)。隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，TP的含量顯著減少了(P<0.05)，NH3-N的含量也隨之顯著提高(P<0.01)。AVEO與青貯時(shí)間的交互作用對(duì)紫花苜蓿青貯蛋白質(zhì)組分無(wú)顯著影響。

表3 紫花苜蓿青貯的蛋白質(zhì)組分

3 討論

3.1 紫花苜蓿原料特性

本研究中紫花苜蓿原料DM含量為299 g·kg-1FM，屬于高水分牧草，有利于梭狀芽孢桿菌等腐敗微生物的發(fā)酵，難獲得發(fā)酵品質(zhì)高的青貯飼料[21]。紫花苜蓿原料CP含量為141 g·kg-1，低于李菲菲[22]、于浩然[23]和羅穎潔[24]等人報(bào)道的18%～23%，這可能與牧草生長(zhǎng)的氣候、地理位置以及刈割時(shí)期有關(guān)。

牧草附著的乳酸菌能夠?qū)SC通過(guò)同型發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乳酸，是保證青貯發(fā)酵品質(zhì)良好的重要條件[25]。紫花苜蓿原料的外附乳酸菌數(shù)量為6.68 lg cfu·g-1FM，高于良好發(fā)酵對(duì)乳酸菌數(shù)量要求的理論值5.0 lg cfu·g-1FM，有利于青貯發(fā)酵[26]。

3.2 AVEO對(duì)紫花苜蓿發(fā)酵品質(zhì)影響

pH值是衡量青貯發(fā)酵過(guò)程優(yōu)劣最直觀的指標(biāo)。青貯pH值的降低主要?dú)w因于乳酸菌將WSC轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸[27]。青貯30 d后，用0.5% AVEO和1%AVEO處理的紫花苜蓿青貯的pH值分別為4.91和4.89，均不能達(dá)到發(fā)酵良好的理論pH值4.2[27]。這與WSC(33.2 g·kg-1DM)含量較低有關(guān)，WSC的含量高于50 g·kg-1DM是保證發(fā)酵品質(zhì)良好的閾值，尤其是在高水分青貯中，高水分會(huì)稀釋W(xué)SC的濃度并降低pH的下降速率為有害微生物的增長(zhǎng)創(chuàng)造條件[28-29]。萬(wàn)里強(qiáng)[30]和李艷芬[31]等人也報(bào)道了在不做任何處理的情況下，紫花苜蓿中低WSC含量會(huì)導(dǎo)致紫花苜蓿青貯的高pH值。與CK相比，添加1% AVEO紫花苜蓿青貯乳酸的含量在青貯第30 d從12.0 g·kg-1DM增加到了13.0 g·kg-1DM(P< 0.05)，隨著乳酸含量的增多紫花苜蓿青貯的pH值從5.05下降到了4.89。乳酸的累積量增多可能是精油廣譜的抑菌活性抑制了大腸桿菌等不良微生物的代謝乳酸的能力[8,13,27]。在青貯的第15 d，添加1% AVEO的紫花苜蓿青貯中大腸桿菌受到抑制，數(shù)量從5.79 lg cfu·g-1FM下降到了4.29 lg cfu·g-1FM(P<0.05)。這與Tsurumi等人[32]報(bào)道一致，其研究表明AVEO對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和綠膿桿菌均有顯著的抑菌作用。與青貯第15 d相比，青貯第30 d乙酸含量在CK，0.5% AVEO和1% AVEO組中顯著增加。紫花苜蓿原料的酵母菌數(shù)量5.06 lg cfu·g-1FM，然而在紫花苜蓿青貯中未檢測(cè)到酵母菌，這可能與乙酸對(duì)酵母菌有較強(qiáng)的抑制作用有關(guān)[25]。本研究中未檢測(cè)到丁酸，表明紫花苜蓿發(fā)酵品質(zhì)良好，不良發(fā)酵較少。青貯30 d后，0.5% AVEO和1%SERO處理的紫花苜蓿青貯干物質(zhì)的回收率分別從95.3%顯著提高到98.6%和103%，意味著紫花苜蓿青貯可供動(dòng)物消化的養(yǎng)分含量提高了，在生產(chǎn)上能帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

3.3 AVEO對(duì)紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

在青貯過(guò)程中，真蛋白的水解主要有兩條途徑：一是不良微生物分泌蛋白質(zhì)水解酶促進(jìn)蛋白質(zhì)肽鍵的水解、多肽和氨基酸的脫氨；二是植物自身的蛋白質(zhì)水解酶促進(jìn)蛋白質(zhì)的水解[21]。真蛋白的水解會(huì)直接導(dǎo)致NPN和NH3-N含量的增加，降低青貯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[33]。反芻動(dòng)物對(duì)NPN的利用效率遠(yuǎn)低于TP，因此TP的保存效果也決定著青貯飼喂價(jià)值[27]。在本研究中，在青貯30 d后，添加了0.5% AVEO和1% AVEO的紫花苜蓿青貯的TP含量分別從54.4 g·kg-1DM顯著提高到了57.9 g·kg-1DM和59.9 g·kg-1DM (P<0.05)。同時(shí)，與CK相比添加AVEO的紫花苜蓿青貯中NPN和NH3-N的含量有所降低。據(jù)Muck[25]報(bào)道，厭氧型大腸桿菌會(huì)促進(jìn)青貯的腐敗變質(zhì)。本研究中，添加1%AVEO對(duì)大腸桿菌顯著的抑制效果可能是紫花苜蓿青貯蛋白質(zhì)品質(zhì)顯著提高的主要原因。隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，NH3-N含量顯著提高(P<0.01)，紫花苜蓿青貯的蛋白質(zhì)品質(zhì)下降，這可能是由于發(fā)酵過(guò)程破壞植物細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)，造成植物自身蛋白酶外滲所引起的蛋白質(zhì)水解[26]。在不同的青貯材料中，陶蓮[34]、郭金桂[35]和姜俊芳[36]等人均在青貯的動(dòng)態(tài)研究中發(fā)現(xiàn)，青貯時(shí)間與氨態(tài)氮含量呈正相關(guān)關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，添加AVEO精油顯著降低了紫花苜蓿青貯的pH值，提高了乳酸含量、干物質(zhì)回收率和真蛋白的含量，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)效價(jià)。在紫花苜蓿中添加1% AVEO有助于改善青貯的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。