陸永祥， 嚴顯明， 周朝相， 朱會先， 茍文龍， 游明鴻， 李達旭， 陳仕勇，李 平*, 白史且*

(1. 西南民族大學, 四川 成都 610041； 2. 會東縣黑山羊研究所， 四川 會東 615200； 3. 四川省草原科學研究院， 四川 成都 611731)

青貯玉米(ZeamaysL.)，尤其是青貯后的全株玉米因其能值高、易消化、適口性好等優(yōu)點，已成為反芻家畜日糧中主要有效成分，也是我國“糧改飼”的主推作物之一[1-2]。此外，發(fā)展全株玉米青貯還能夠解決當前青飼作物產(chǎn)能不足的問題，增加農(nóng)民收入[3]。然而，全株玉米的青貯品質(zhì)受很多因素影響，水分是影響其青貯品質(zhì)的一個重要因素[4]。四川省屬于亞熱帶季風氣候地區(qū)，夏季多雨陰濕，農(nóng)業(yè)機械化程度較低，收獲的全株玉米青貯時水分含量較高，而原料水分過高易造成腐敗，導致青貯飼料品質(zhì)下降[5]，不利于全株玉米青貯飼料的推廣與利用。

許多研究已證明，選擇合適的添加劑可以提高高水分飼草料青貯的發(fā)酵品質(zhì)[6]。目前，青貯添加劑按組成可分為微生物和化學添加劑，而乳酸菌制劑和無機鹽則是這2類常用的添加劑[7-8]。此外，青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的好壞受其所含微生物的種類以及它們代謝活動的影響，了解微生物的活動規(guī)律對于改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)具有重要意義[9-10]。因此，本試驗以全株玉米為研究對象，通過添加植物乳桿菌和苯甲酸鈉來探究不同添加劑對高水分全株玉米青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和細菌群落組成的影響，以期為該區(qū)域后期全株玉米的青貯研究提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 青貯調(diào)制

本試驗在成都四川省草原科學研究院韓場實驗基地(30°27′N，103°43′E，海拔502 m)進行。本試驗選取乳熟期的全株玉米作為青貯原料，將青貯原料按1～2 cm的理論長度切碎，切碎后的青貯原料隨機分成3等份，用于以下處理：(1)對照(CK)；(2)添加植物乳桿菌制劑(LP，由四川省草原科學研究院提供，菌株編號BT12；添加量為1×106cfu·g-1FM)；(3)添加苯甲酸鈉(BS，添加量為0.1% FM)，每種處理設置3個重復。再利用青貯打捆包膜機(ST5552A，山東圣泰機械制造有限公司，山東，中國)制成小捆青貯飼料(0.52 m×0.55 m?；密度約為55 kg·hm-3Fresh weight,FM)，在室溫環(huán)境下貯存60 d。

1.2 營養(yǎng)成分測定

將青貯樣品放置于65℃的烘箱中烘干至恒重后測定其干物質(zhì)(dry matter,DM)含量[11]，然后將樣品通過1 mm篩子研磨以進行其他營養(yǎng)成分分析。利用凱氏定氮法測定粗蛋白(crude protein,CP)含量[12]，使用Ankom 2000纖維分析儀(Ankom Technology，F(xiàn)airport，NY)測定中性洗滌劑纖維(neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌劑纖維(acid detergent fiber,ADF)含量[13]，可溶性碳水化合物含量(water soluble carbohydrate,WSC)則通過蒽酮-硫酸比色法測定[14]。

1.3 發(fā)酵指標測定

在Stomacher攪拌機中將20 g的新鮮樣品與180 mL超純水混合3 min，4層無菌紗布過濾后，用pH計測定濾液的pH值。將濾液(約10 mL)離心(4 500 g，15 min，4℃)，并采用高效液相色譜法分析上清液中的乳酸(lactic acid,LA)，乙酸(acetic acid,AA)和丙酸(propionic acid,PA)含量[15]。采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定濾液中氨態(tài)氮(ammonia nitrogen,AN)含量[16]。

1.4 細菌多樣性分析

根據(jù)Li等人[17]所述的方法提取青貯飼料樣品中細菌的DNA，使用Phusion?高保真PCR預混液(New England Biolabs)進行PCR反應。選擇515F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和907R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGC-3)作為引物來擴增16S rRNA基因，使用Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen，德國)來純化PCR產(chǎn)物，然后在Novogene Company使用IlluminaMiSeq PE2500平臺的成對末端(250 bp)測序。排出純化的PCR產(chǎn)物中的條形碼和引物，以獲得高質(zhì)量的序列。測序后，使用Trimmomatic處理原始序列，PE讀數(shù)與FLASH(V 1.2.7)重疊，以組裝最終的V3-V4標簽序列。有效標簽是通過Uchime(4.2.40版)方法生成，在Usearch軟件平臺(版本7.1)上，采用uparse方法將操作分類單元(OTU)分配給截止水平為3%的16S rRNA，根據(jù)OTU的結(jié)果，使用Mothur(版本v.1.30.1)生成α多樣性(Chao 1和Shannon指數(shù))。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對青貯樣品60 d后的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，通過Tukey的Studentized范圍檢驗確定平均值之間的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加劑對高水分全株玉米青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

由表1可知，與CK和LP處理相比，BS處理的玉米青貯飼料中WSC含量顯著增加(P<0.05)。此外，LP處理的玉米青貯飼料中NDF含量顯著高于CK(P<0.05)。

表1 添加劑對高水分全株玉米青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

2.2 添加劑對高水分全株玉米青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表2可知，與CK和LP處理相比，BS處理的玉米青貯飼料中pH值顯著升高(P<0.05)。此外，LP處理的玉米青貯飼料中AN含量顯著高于CK(P<0.05)。

表2 添加劑對高水分全株玉米青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.3 添加劑對高水分全株玉米青貯飼料微生物alpha多樣性的影響

由表3可知，LP處理的玉米青貯后，其覆蓋率顯著低于CK，觀測到的物種數(shù)顯著高于CK(P<0.05)。2種添加劑處理的玉米青貯飼料中微生物多樣性(包括Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù))高于CK。

表3 添加劑對高水分全株玉米青貯飼料微生物alpha多樣性的影響

如圖1所示，CK中主要的微生物為短乳桿菌屬(Lactobacillusbrevis)細菌，其次為植物乳桿菌屬(Lactobacillusplantarum)和人參乳桿菌屬(Lactobacillusginsenosidimutans)細菌。玉米經(jīng)2種添加劑處理青貯后，其細菌群落組成發(fā)生一定變化。與CK相比，2種添加劑處理的玉米青貯飼料中短乳桿菌屬(Lactobacillusbrevis)細菌的相對豐富度降低，植物乳桿菌屬(Lactobacillusplantarum)和斯比氏乳桿菌屬(Lactobacillusspicheri)細菌相對豐富度增加。

圖1 添加劑對高水分全株玉米青貯飼料樣本在屬水平上的細菌豐富度

在青貯發(fā)酵過程中，飼料發(fā)酵特性的變化與微生物群落的代謝作用密切相關。從發(fā)酵特性與青貯飼料中微生物相關性之間的關系來看(圖2)，玉米青貯飼料中斯比氏乳桿菌屬(Lactobacillusspich-eri)細菌與氨態(tài)氮的含量呈正相關(P<0.05)，與乙酸的含量呈極正相關(P<0.01)。短乳桿菌屬(Lactobacillusbrevis)細菌與氨態(tài)氮含量呈負相關(P<0.05)。

圖2 影響高水分全株玉米青貯飼料細菌屬水平群落組成的環(huán)境影響因子

3 討論

3.1 添加劑對高水分全株玉米青貯飼料營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響

苯甲酸鈉是一種發(fā)酵抑制劑，它可以有效抑制霉菌和酵母菌等不良微生物的生長[18]，減少其對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，使得WSC得以保存。因而，BS處理的青貯飼料中WSC含量高于對照。pH是評價青貯飼料品質(zhì)的直觀指標。本研究中，所有處理組的pH值均低于4.2，達到優(yōu)質(zhì)青貯飼料標準。而BS處理的玉米青貯飼料pH值高于對照可能是乳酸發(fā)酵受阻。Kung的研究結(jié)果表明，乳酸發(fā)酵受阻會導致青貯飼料的pH值升高[19]。本研究中，用LP處理的玉米青貯后，其AN含量高于對照，這與苗芳等人的研究結(jié)果類似[20]。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是植物乳桿菌的接種效果不理想，不能有效抑制青貯過程中微生物和植物蛋白酶對氨基酸和蛋白質(zhì)的降解[21]。

3.2 添加劑對高水分全株玉米青貯飼料微生物多樣性的影響

本研究中，LP處理的玉米青貯飼料中觀測的物種數(shù)量和微生物多樣性高于對照，這可能與玉米的含水量高有關。王飛等人的研究表明，外源乳酸菌在高水分的青貯飼料中接種效果會減弱，不能有效地抑制不良微生物的生長和繁殖[22-23]。BS處理的玉米青貯飼料中微生物多樣性高于對照可能與其pH值高于對照有關。有研究表明，青貯飼料的pH值過高會導致微生物多樣性增加[24]。

3.3 添加劑對高水分全株玉米青貯飼料細菌群落組成的影響

高水分全株玉米青貯后，乳桿菌屬細菌成為主要的優(yōu)勢菌群，這與付彤的研究結(jié)果類似[25]。Ni等人報道，乳桿菌的存在有利于青貯飼料的乳酸發(fā)酵，在青貯后期降低pH值方面起到重要作用[26]。本研究中，2種添加劑處理的玉米青貯飼料中斯比氏乳桿菌屬和植物乳桿菌屬細菌相對豐富度增加。斯比氏乳桿菌是一種可以產(chǎn)細菌素的乳酸菌，它的存在會抑制金黃葡萄球菌、梭菌和蠟狀芽孢桿菌等不良微生物的生長[27]。而植物乳桿菌是一種同型發(fā)酵乳酸菌，它可以增加青貯飼料中乳酸含量，迅速降低pH值，避免青貯飼料中營養(yǎng)物質(zhì)被一些不耐酸的有害微生物分解[20]。理論上，2種添加劑的處理可以改善全株玉米青貯飼料的品質(zhì)。然而，2種添加劑的處理卻導致全株玉米青貯飼料中短乳桿菌屬細菌相對豐富度降低。這可能與其他乳桿菌屬細菌相對豐富度的增加有關(圖1)，其他乳桿菌數(shù)量的增多會與短乳桿菌競爭有限的營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制短乳桿菌的生長和繁殖。短乳桿菌作為一種異型發(fā)酵乳酸菌，在發(fā)酵的過程中會產(chǎn)生大量具有抗菌性極強的揮發(fā)性脂肪酸，能夠提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[28]，其數(shù)量的減少會增加青貯飼料有氧變質(zhì)的機率。因此，2種添加劑的處理對全株玉米青貯飼料品質(zhì)的改善作用是有限的。

3.4 高水分全株玉米青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)與細菌群落組成的相關性

青貯發(fā)酵是一個復雜的過程，微生物在青貯發(fā)酵的過程中起著至關重要的作用，斯比氏乳桿菌屬于專性異源發(fā)酵菌，它可以在厭氧條件下將乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸和1,2-丙二醇等產(chǎn)物[29]。所以在一定條件下斯比氏乳桿菌數(shù)量的增加，會提高青貯飼料中乙酸的濃度。本研究中，短乳桿菌數(shù)量與氨態(tài)氮含量成反比，這可能與短乳桿菌的發(fā)酵類型有關。短乳桿菌是一種異型發(fā)酵乳酸菌，在發(fā)酵時會生成乙酸等抑菌物質(zhì)，抑制某些代謝產(chǎn)物為氨態(tài)氮的微生物生長，因此，短乳桿菌數(shù)量的增加會導致這類微生物數(shù)量的減少，從而使青貯飼料中氨態(tài)氮含量下降[30]。

4 結(jié)論

2種添加劑均使高水分全株玉米青貯飼料的細菌群落組成發(fā)生一定變化，高水分全株玉米青貯飼料以乳桿菌屬細菌為優(yōu)勢菌群(>70%)，2種添加劑均使高水分全株玉米青貯飼料中植物乳桿菌屬和斯比氏乳桿菌屬細菌相對豐富度增加，此外，2種添加劑均使高水分全株玉米青貯飼料的細菌多樣性增加。與對照相比，苯甲酸鈉處理的高水分全株玉米青貯后pH值升高，氨態(tài)氮含量增加，有機酸含量減少。植物乳桿菌處理的高水分全株玉米青貯飼料中有機酸和氨態(tài)氮含量增加，pH值降低，但效果不明顯。因而，對于高水分全株玉米青貯飼料，添加苯甲酸鈉和植物乳桿菌對其品質(zhì)改良無顯著作用。