程珍珍，周本宏，姜 珊，李曠宇，金 丹

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430072)

沒食子酸(Gallic acid)是石榴皮中可水解鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物，是石榴皮中沒食子苷的重要生物活性成分之一。已有大量研究表明，沒食子酸具有多種生物活性，如抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎、心臟保護和神經(jīng)保護等作用[1-5]。原位單向腸灌流是研究藥物在腸道不同區(qū)域的通透性和腸道吸收機制最常用的方法[6-7]。本研究采用原位單向腸灌流模型，研究沒食子酸在大鼠各腸段的吸收特性。同時考察不同腸段、藥物濃度、時間、pH值、P-gp、MRP2對藥物吸收的影響。為提高鞣質(zhì)類成分口服制劑的生物利用度提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑沒食子酸標準品(成都曼斯特，16022801，純度99%)；葛根素標準品(阿拉丁，P111269，純度≥98%)；鹽酸維拉帕米(阿拉丁，K1629079)；吲哚美辛(阿拉丁，C1723020);甲醇、乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器BT1-200恒流泵(上海琪特分析儀器有限公司)；HX1002T電子天平(武漢世紀超杰實驗儀器有限公司)；分析天平(德國Sartorius)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)；LGC-1025M柱溫箱(荊州市津?；た萍加邢薰?；色譜柱(英國Fortis)；實驗室pH計(瑞士Mettler Toledo)。

1.3 實驗動物SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，合格證號SCXK(鄂)2015-0018，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗中心提供，實驗前在實驗環(huán)境中適應(yīng) 1 周。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1Krebs-Ringer’s溶液的配制 稱取NaCl 7.8 g、NaHCO31.37 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、MgCl20.02 g、NaH2PO40.32 g、葡萄糖1.40 g，加水定容至1 000 mL，即得(pH 7.4)。

2.1.2對照品溶液的配制 取2.00 mg沒食子酸標準品，精密稱定，用甲醇溶解后，于25 mL棕色容量瓶中定容，并作為母液貯存于4 ℃冰箱。

2.1.3內(nèi)標溶液的配制 本實驗選用葛根素為內(nèi)標物質(zhì)，取葛根素標準品配制濃度為100 mg·L-1的溶液于10 mL容量瓶中，貯存于4 ℃環(huán)境中備用。

2.1.4供試品溶液的配制 精密稱定沒食子酸適量，用空白腸循環(huán)液溶解并稀釋成含沒食子酸質(zhì)量濃度分別為 20、40、80 mg·L-1的溶液，即得。

2.2 沒食子酸的定量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱為C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相，有機相乙腈(A)，水相三氟乙酸(B)，洗脫條件如下：0-8min，B 98%-78% 梯度洗脫，8-15min，B為78% 等度洗脫；流速1.00 mL·min-1；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.2.2標準曲線的繪制 分別精密吸取對照品母液0.625 mL、1.250 mL、2.500 mL、3.750 mL、5.625 mL、10.000 mL，加溶劑定容于10.00 mL棕色容量瓶中。每個濃度對照品按照“2.2.1項”色譜條件下實驗條件連續(xù)進樣3次，得出峰面積值，以對照品濃度x軸，對照品和內(nèi)標峰面積比值y軸繪制標準曲線。得出曲線公式：y=0.307 4 x+0.648 1，R2=0.999 5，沒食子酸在5.00-80.00 mg·L-1呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3精密度考察 日內(nèi)精密度考察：取“2.1.2項”條件下配制的對照品母液，稀釋高、中、低3個不同濃度，按照“2.2.1項”色譜條件每隔2 h進樣1次，相同方法進樣5次，求出峰面積的RSD值。日間精密度：按照日內(nèi)精密度的測定方法，連續(xù)測定5 d，計算每日峰面積平均值的RSD值。結(jié)果顯示高、中、低3個質(zhì)量濃度各指標成分峰面積RSD值均小于3%，表明該方法精密度良好。

2.2.4穩(wěn)定性考察 按照“2.1.2項”方法平行配制樣品3份，取5.00 mL，加腸灌流液定容至10.00 mL于棕色容量瓶中，進行預(yù)處理后從0 min開始進樣，后第30 min、第60 min、第90 min、第120 min、第150 min分別進樣，將每個時間點的峰面積與初始時間峰面積做對比。結(jié)果表明，沒食子酸在腸灌流液中的穩(wěn)定性符合要求，滿足測定要求。

2.2.5專屬性考察 分別取大鼠空白腸灌流液、空白腸灌流液加沒食子酸標準品及內(nèi)標、沒食子酸腸灌流液，預(yù)處理后按照“2.2.1項”色譜下條件進樣分析，得到灌流液中沒食子酸色譜圖。結(jié)果顯示沒食子酸峰形良好，與內(nèi)標物分離完全。內(nèi)源性物質(zhì)對藥物測定的影響忽略不計，該方法具有較好的專屬性。

2.2.6回收率考察 取采集后的高、中、低3個不同濃度的腸灌流液，加入已知濃度的對照品溶液，按照“2.2.1項”色譜下條件下進樣分析，得到峰面積，按照公式：回收率/%=(加入標準樣品量-樣品含量)/加入標準樣品量×100%進行計算，得到不同濃度樣品的加樣回收率。結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.3 大鼠在體單向腸灌流實驗[8]取已禁食12 h(不禁水)健康SD大鼠，大鼠腹腔注射水合氯醛300 mg·kg-1麻醉后，固定，沿腹中線剪開小口，將大鼠腸道暴露，小腸兩端插管并結(jié)扎。用預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水排凈腸道內(nèi)容物，換成空白K-R液，平衡15 min，再更換為含藥腸灌流液將管道飽和15 min，直至出液口溶液與進液口溶液中藥物的質(zhì)量濃度相等，消除實驗過程中腸道對藥物的吸附作用。降低灌流體積流量0.20 mL·min-1，每15 min更換1次灌流液和收集瓶，實驗持續(xù)90 min，實驗結(jié)束后將大鼠處死，剪下灌流腸段，在37 ℃生理鹽水浸潤下剪開腸段，測量其長度(l)和橫截面半徑(r)。

2.4 腸吸收參數(shù)計算在體單向腸灌流模型用重量法對灌流液的流入和流出的體積進行校正，消除其體積變化的影響[9]。吸收率常數(shù)(Ka)和有效表觀滲透率系數(shù)(Peff)的計算公式如下:

Ka=(1-CoutQout/CinQin)Q/πr2l

Peff=[Q×ln (CoutQout/CinQin)]/2πrl

其中，Qin和Qout分別為腸段灌入的灌流液和收集液的體積(mL，假定灌流液和收集液的質(zhì)量濃度為1.0 kg·L-1)，Q為灌流體積流量(0.20 mL·min-1)，Cin 和Cout分別為灌流液和收集液的藥液質(zhì)量濃度(mg·L-1)，l和r分別為被測段的長度(cm)和半徑(cm)。

3 結(jié)果

3.1 不同腸段對藥物吸收的影響取沒食子酸質(zhì)量濃度為40 mg·L-1的供試液，按“2.3”項操作，考察藥物在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸4個腸段的吸收情況。計算Ka和Peff值，結(jié)果見Tab 1。結(jié)果表明，沒食子酸在不同腸段均有吸收，其在不同腸段的Ka大小順序是空腸>十二指腸>回腸≈結(jié)腸。除空腸與結(jié)腸(Ka、Peff值比較)之間無差異外，其他各組之間差異有顯著性(P<0.05)。腸道上端沒食子酸的吸收優(yōu)于腸道下端的吸收。

Tab 1 Absorption of gallic acid at various segments in intestine of rats n=5)

3.2 不同藥物質(zhì)量濃度對腸吸收的影響以空腸為考察腸段，取質(zhì)量濃度為20、40、80 mg·L-1的供試液，按“2.3”項下的方法操作，分別進行實驗，考察藥物質(zhì)量濃度對吸收的影響。計算Ka、Peff 值，結(jié)果見Tab 2。不同質(zhì)量濃度下沒食子酸大鼠空腸吸收參數(shù)差異沒有顯著性(P>0.05)，提示沒食子酸在小腸的吸收沒有濃度依賴性，吸收機制為被動擴散。

Tab 2 Effect of drug concentration on Ka and Peff of gallic acid n=5)

3.3 不同pH值對腸吸收的影響分別用稀HCl和稀NaOH溶液調(diào)節(jié)K-R緩沖液pH值為5.4和6.8，配制不同pH值的灌流液(沒食子酸40 mg·L-1)，考察 pH 值對藥物吸收的影響。結(jié)果如Tab 3所示，當(dāng)介質(zhì)pH 值升高時，沒食子酸在空腸的Ka、Peff 值明顯降低(P<0.05)。

Tab 3 Effect of pH value on Ka and Peff of

3.4 P-gp對腸吸收的影響按“2.3”項下的方法操作，以空腸為考察腸段，考察 P-gp 抑制劑對藥物吸收的影響。計算Ka和Peff，結(jié)果如Tab 4所示，加入維拉帕米(P-gp抑制劑)后，沒食子酸吸收增加(P<0.05)，表明沒食子酸可能是P-gp底物。沒食子酸的吸收受到P-gp外排作用的影響。

Tab 4 Effect of P-gp on Ka and Peff of gallic acid n=5)

3.5 MRP2對腸吸收的影響按“2.3”項下的方法操作，以空腸為考察腸段，考察MRP2抑制劑對藥物吸收的影響。計算Ka和Peff，結(jié)果如Tab 5所示，加入吲哚美辛(MRP2抑制劑)后，沒食子酸吸收增加(P<0.05)，表明沒食子酸可能是MRP2底物。

Tab 5 Effect of MRP2 on Ka and Peff of gallic acid n=5)

4 討論

腸道吸收對口服藥物的生物利用度起著至關(guān)重要的作用。在腸道中，有許多參與藥物藥代動力學(xué)過程的運輸?shù)鞍?。因此，研究其轉(zhuǎn)運機制對提高其有效性和安全性具有重要意義[10]。

近年來，國內(nèi)外對沒食子酸的藥理活性研究很多，然而對其腸吸收的機制研究相對較少。我們之前的研究闡述了沒食子酸在Caco-2細胞單分子膜上的轉(zhuǎn)運和吸收特性[11]。然而，目前為止，利用原位單向腸灌流法研究沒食子酸在腸道中的吸收還沒有被報道，沒食子酸的吸收機制尚未完全闡明。因此，本研究采用原位單向腸灌流模型，進一步探究不同濃度沒食子酸在小腸不同腸段的腸道吸收機制以及影響腸道吸收的因素。

在單向腸灌流中可以看出，隨著沒食子酸濃度的增加，腸道中的Peff值無明顯差異，說明沒食子酸在腸道的吸收方式主要是被動擴散。對于被動轉(zhuǎn)運，不存在飽和，藥物可以沿濃度梯度在沒有ATP的情況下跨膜轉(zhuǎn)運，包括載體轉(zhuǎn)運、細胞外轉(zhuǎn)運和細胞旁轉(zhuǎn)運。根據(jù)文獻，當(dāng)Peff值<3×10-6cm·s-1時，說明藥物吸收不良，當(dāng)Peff值>2×10-5cm·s-1時，藥物吸收良好[12]。在我們的研究中，沒食子酸在4個腸段中的Peff值均>2×10-5cm·s-1。因此，沒食子酸在腸內(nèi)吸收良好。沒食子酸在小腸上端的吸收好于小腸下端的吸收。可能原因是不同腸段存在生理差異，包括膜成分、粘膜厚度、酶活性、轉(zhuǎn)運數(shù)量和能力等[13]。在酸性條件下，沒食子酸的吸收較好?？赡苁怯捎跊]食子酸呈酸性，所以在酸性條件下它可能能夠被更好地吸收。

P-糖蛋白(P-gp)和多藥耐藥相關(guān)蛋白-2(MRP2)主要分布于細胞質(zhì)膜上，是影響藥物在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)運的主要外排轉(zhuǎn)運蛋白[14]。我們的研究表明，維拉帕米(P-糖蛋白抑制劑)和吲哚美辛(MRP2抑制劑)顯著增加空腸沒食子酸的有效表觀滲透率系數(shù)值，說明腸道對沒食子酸的吸收受到外排轉(zhuǎn)運體(P-gp、MRP2)的影響。

綜上，沒食子酸的吸收機制可能是被動擴散，沒食子酸在小腸內(nèi)吸收良好。細胞旁轉(zhuǎn)運通路和外排轉(zhuǎn)運體也參與了沒食子酸的轉(zhuǎn)運。P-gp和MRP2可能參與沒食子酸的腸道吸收。此外，沒食子酸在全腸段都能吸收，腸道上端沒食子酸的吸收優(yōu)于腸道下端的吸收。本實驗利用大鼠在體單向腸灌流模型，闡明了沒食子酸在腸道中的吸收特性。對于進一步研究鞣質(zhì)類成分的作用機制、提高生物利用度、指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的意義。