張蕓綺，藺曉菁，王妙然，李 月，樊 雷，侯 毅，肖曉秋

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院重大代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室、2.藥學(xué)院、3.實驗教學(xué)管理中心中醫(yī)藥實驗室，重慶 400016)

糖尿病是由遺傳與環(huán)境因素引起的代謝紊亂，主要體現(xiàn)為胰島素不敏感、缺乏以及相關(guān)功能受損。由于這種疾病的高流行率以及相關(guān)的殘疾和死亡率，它已成為全世界嚴(yán)重的健康問題之一[1]。流行病學(xué)結(jié)果調(diào)查顯示，中國成年人中糖尿病的患病率從2007年的9.7%增長至2017年的11.2%，患者總數(shù)估計為1.298億人[2]，無疑給社會和經(jīng)濟發(fā)展帶來了沉重負(fù)擔(dān)。病因上，世衛(wèi)組織將糖尿病歸類為1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、妊娠期糖尿病和其他特定類型的糖尿病[3]。T1DM是一種自身免疫系統(tǒng)疾病[4]，特征為淋巴細(xì)胞介導(dǎo)破壞胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素絕對分泌不足[5]。T2DM是一種受年齡、懷孕和肥胖等生活方式因素影響的最常見的糖尿病，越來越多的證據(jù)表明，T2DM的胰島素釋放同樣受損[6]。胰島的大小、數(shù)目和功能是胰島β細(xì)胞分泌胰島素的關(guān)鍵，胰島β細(xì)胞受損或凋亡會顯著降低胰島素分泌水平，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[7]。由此可知，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，減少其凋亡是防治糖尿病的有效手段。

橙皮苷(hesperidin，HSD)最初由法國化學(xué)家Lebreton從柑橘皮中分離出來[8]，是一種黃酮類化合物。黃酮類化合物在植物體內(nèi)有著廣泛的分布，主要以游離狀態(tài)或糖苷的形式存在，具有一定的抗氧化、抗癌以及抗炎等作用[9]。研究表明HSD除通過抗氧化、抗炎等作用間接改善糖尿病外，還可能具有保護(hù)大鼠胰島β細(xì)胞和改善其功能的潛力[10]。但目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)明確HSD對胰島β細(xì)胞的體外保護(hù)作用及其機制，因此本研究將進(jìn)一步采用體外培養(yǎng)探討HSD對胰島β細(xì)胞活性及胰島素分泌功能的影響，為HSD的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑 橙皮苷(純度≥98%)由重慶醫(yī)科大學(xué)侯毅老師惠贈。RPMI 1640 培養(yǎng)基(貨號：C11875500BT)、胎牛血清(貨號：10099141)購自美國Gibco公司，Hoechst 33258 溶液(貨號:C0003)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(貨號：P0009)購自碧云天公司；棕櫚酸(palmitic acid，PA)購自美國Sigma公司(貨號：P0500)；CCK-8試劑盒(貨號：CK04)購自日本同仁化學(xué)研究所，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：RR047A)、SYBR-Green熒光定量PCR試劑(貨號：RR820A)購自TaKaRa公司；小鼠胰島素ELISA試劑盒(貨號：CSB-E05071m)購自武漢華美公司；ECL發(fā)光液(貨號:k12045-D10)購自美國advansta公司。

1.1.2實驗儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；正置熒光顯微鏡購自德國Leica公司；定量PCR儀、電泳儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠/發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自法國Vilber Lourmat公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞由本實驗室保存。MIN6細(xì)胞在RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清與1%青霉素-鏈霉素)，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁達(dá)80%-90%后傳代。

1.2.2原代胰島的分離與提取 使用頸椎脫臼法處死小鼠，用體積分?jǐn)?shù)為75的酒精浸泡消毒后迅速打開腹腔找到膽總管,用止血鉗夾閉膽總管匯入十二指腸的入口處,分離膽總管,經(jīng)膽總管近端緩慢注入0.65 g·L-1膠原酶P ( Krebs緩沖液溶解，無菌過濾) 溶液2 mL,胰腺充分膨脹后，剪下胰腺，放入含Krebs膠原酶的離心管中,37 ℃水浴消化15 min,充分振搖，添加Krebs緩沖液終止消化，50目濾網(wǎng)過濾處理后，按照1.4×103r·min-1轉(zhuǎn)速離心15 s，棄上清,使用Krebs緩沖液重懸，重復(fù)3次，在顯微鏡下手工挑取胰島，置于RPIM 1640完全培養(yǎng)基中。挑取后的胰島放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活性 將MIN6細(xì)胞以 6×103/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h貼壁，分別用含0、10、20、40、80、160 μmol·L-1濃度HSD的無血清培養(yǎng)基預(yù)孵育4 h后，換用含33.3 mmol·L-1葡萄糖和0.25 mmol·L-1PA的高糖高脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，并設(shè)無細(xì)胞空白組以及5.5 mmol·L-1正常糖組。每孔加入新鮮無血清培養(yǎng)基90 μL及10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度(A)值，實驗重復(fù)3次。細(xì)胞存活率/%=(A實驗組 - A空白組)/(A對照組 - A空白組)×100%。

1.2.4細(xì)胞分組及處理 將MIN6細(xì)胞以2×105/孔接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板。貼壁后處理細(xì)胞，分為4組：① 5.5 mmol·L-1正常糖對照組(Control組)；②高脂高糖(33.3 mmol·L-1葡萄糖+0.25 mmol·L-1PA)實驗組(HFHG組)；③ 20 μmol·L-1HSD預(yù)處理4 h+HFHG處理24 h組；④ 40 μmol·L-1HSD預(yù)處理4 h+HFHG處理24 h組。

1.2.5Hoechst 33258檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞2×105/孔接種于放有細(xì)胞爬片的12孔板中，貼壁后對細(xì)胞分組進(jìn)行處理，到時間后，將培養(yǎng)基去除，使用PBS清洗3次，每次3 min。在孔中添加0.5 mL 4%多聚甲醛溶液，固定時間為10 min，PBS洗滌。每孔加0.5 mL Hoechst 33258染色液，避光染色15 min，PBS洗滌，加入抗熒光淬滅封片液封片，正置熒光顯微鏡檢測各組細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮情況。

1.2.6Western blot 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定濃度。依照20 μg上樣量，明確上樣體積，使用SDS-PAGE凝膠電泳方法，濕法轉(zhuǎn)入PVDF膜，封閉2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。4 ℃孵育一抗，低速搖床上過夜。次日TBST洗膜，加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠或山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。使用Fusion FX Spectra system自帶圖像分析軟件分析圖像。

1.2.7實時熒光定量PCR TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，Nanodrop 2000檢測濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性4 s，58 ℃退火10 s，65 ℃延伸5 s，共40個循環(huán)。PCR 擴增目的基因上、下游引物序列見 Tab 1。計算2-△△Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的RNA表達(dá)水平。

Tab 1 Primer sequence for real-time PCR

1.2.8葡萄糖刺激的胰島素分泌 挑選大小相近的胰島各20個置于12孔板內(nèi)，各組胰島處理同MIN6細(xì)胞，分組處理后，在含有2.8 mmol·L-1葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液(KRB)中洗滌并預(yù)孵育30 min；再孵育2 h，將上清液收集，-20 ℃環(huán)境下保存；之后在16.7 mmol·L-1葡萄糖的KRB中再孵育2 h，收集上清，-20 ℃保存。最后將各組胰島總蛋白提取出來，測定濃度；ELISA檢測上清液中胰島素含量。

2 結(jié)果

2.1 HSD減少HFHG對MIN6細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡HSD處理24 h對MIN6細(xì)胞活力影響的結(jié)果表明，0-160 μmol·L-1濃度的HSD均不會損害細(xì)胞活性( Fig 1A)。不同濃度的HSD預(yù)處理4 h后用HFHG處理24 h的實驗結(jié)果表明當(dāng)HSD濃度為20-80 μmol·L-1時細(xì)胞存活率高于HFHG實驗組，選用20、40 μmol·L-1濃度的HSD用于之后的實驗(P<0.05,Fig 1B)。

2.2 Hoechst 33258 染色觀察MIN6細(xì)胞核形態(tài)染色后如Fig 2所示，Control組細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，20、40 μmol·L-1HSD預(yù)處理4 h+HFHG處理24 h組與單獨HFHG組比，細(xì)胞核呈致密濃染，細(xì)胞減少(如白色箭頭所示)。由此可知，HSD預(yù)處理后能顯著減少HFHG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.3 HSD對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響觀察20、40 μmol·L-1HSD預(yù)處理4 h + HFHG處理24 h組與單獨HFHG處理組對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。與Control組相比，HFHG組Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05,Fig 3)，與HFHG組比，HSD預(yù)處理后Bcl-2/Bax比值上調(diào)(P<0.01,Fig 3)。

2.4 HSD對炎癥因子表達(dá)的影響與Control組相比，HFHG組IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)均顯著增加，與HFHG組相比，HSD預(yù)處理+HFHG組IL-1β mRNA 的表達(dá)水平有下降趨勢，TNF-α mRNA的表達(dá)下降(P<0.05,Fig 4)。

Fig 1 Effects of different concentrations of HSD on MIN6 cell viability and HFHG- induced apoptosis reduced by HSD n=4)##P<0.01 vs Control group;*P<0.05 vs HFHG group

Fig 2 Effects of HFHG treatment for 24 h after HSD pretreatment for 4 h and HFHG treatment for 24 h on nuclear morphology of MIN6 cells (×200)A:Control;B:HFHG;C:20 μmol·L-1 HSD+HFHG；D：40 μmol·L-1 HSD+HFHG

Fig 3 Effects of HFHG alone and pretreatment with HSD on expression of apoptosis-related proteins n=4)#P<0.05 vs Control;**P<0.01 vs HFHG

Fig 4 Effects of HSD on activities of IL-1β,TNF-α in MIN6 cells treated with HFHG n=3)#P<0.05,##P<0.01 vs Control group;*P<0.05 vs HFHG group

2.5 HSD對胰島素分泌的影響由于MIN6細(xì)胞的胰島素分泌能力較弱，因此提取原代胰島并進(jìn)行相同的分組處理后檢測胰島素分泌。結(jié)果顯示，與Control組相比，高糖刺激下HFHG組胰島的胰島素分泌作用減弱，而HSD一定程度上恢復(fù)了胰島素分泌作用(P<0.05或P<0.01,Fig 5)。

Fig 5 Effects of HSD on glucose-stimulated insulin secretion of islets n=3)##P<0.01 vs Control group;*P<0.05,**P<0.01 vs HFHG group

3 討論

糖尿病是一個日益增長的公共衛(wèi)生問題，不同類型糖尿病病理生理學(xué)的一個共同特征是β細(xì)胞的凋亡和/或β細(xì)胞功能的損害[11]。細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑主要分為內(nèi)源性和外源性途徑，均與糖尿病發(fā)生過程中胰島β細(xì)胞的凋亡有關(guān)[12]。內(nèi)源性途徑通過不同類型的細(xì)胞應(yīng)激(如缺氧或氧化應(yīng)激)激活，其中包括Bcl-2家族的參與[13]。Bcl-2家族分為3類：第一類抑制細(xì)胞凋亡，包括Bcl-2等；第二類促進(jìn)細(xì)胞凋亡，包括Bax等；第三類抑制用作細(xì)胞應(yīng)激傳感器的抗凋亡蛋白來促進(jìn)凋亡信號，包括Bad等[14]。外源性途徑通過如TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子[15-16]與胰島β細(xì)胞表面一些表達(dá)凋亡信號的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號通路誘導(dǎo)凋亡。β細(xì)胞功能的損害主要表現(xiàn)在機體內(nèi)胰島素分泌的減少，而恢復(fù)β細(xì)胞分泌的手段主要包含以下4種：防止其凋亡/功能障礙、促進(jìn)增殖、改善去分化、誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為可以分泌胰島素的β樣細(xì)胞[11]。

本研究從預(yù)防β細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其增殖入手，探究HSD對小鼠胰島 β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞活性的影響。鑒于長期暴露于高水平的葡萄糖和游離脂肪酸會導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙，并誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，實驗選用高糖高脂培養(yǎng)刺激胰島 β細(xì)胞建立β細(xì)胞受損的體外模型。結(jié)果表明，高糖高脂處理后，MIN6細(xì)胞凋亡顯著增加，而HSD預(yù)處理后細(xì)胞凋亡顯著減少。同時，HSD預(yù)處理后增加了MIN6細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)；抑制了促凋亡蛋白Bax，炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)。最后通過原代胰島的葡萄糖刺激胰島素分泌試驗證明HSD預(yù)處理改善了胰島素分泌功能。

綜上所述，高糖高脂環(huán)境能夠使MIN6細(xì)胞活性降低、凋亡增加，胰島的胰島素分泌功能障礙，而HSD預(yù)處理可增加該環(huán)境下Min6細(xì)胞活性、抑制其凋亡，改善胰島的胰島素分泌功能。因此，HSD預(yù)處理對胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過抑制細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑、改善胰島素分泌作用來實現(xiàn)的。