熊曉毅，王劍

1.咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714026

小兒肝炎顆粒是由茵陳、梔子(姜炙)、黃芩、黃柏、焦山楂、大豆黃卷、郁金、通草8味中藥制成的中藥復(fù)方制劑，臨床適用于肝膽濕熱所致的黃疸、協(xié)痛、惡心嘔吐、身體倦懶、皮膚黃染，黃疸型肝炎或無(wú)黃疸型肝炎見(jiàn)上述證候者[1]。方中茵陳具有清利濕熱、利膽退黃等功效，其中含有以綠原酸和濱蒿內(nèi)酯為代表的苯環(huán)有機(jī)酸類和香豆素類等活性物質(zhì)[2]；梔子具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，其主要活性成分是以梔子苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類化合物[3]；黃芩的有效成分是以黃芩苷為代表的黃酮類化合物，這類物質(zhì)具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[4]；黃柏主要活性成分是以小檗堿和黃柏堿為代表的生物堿類物質(zhì)，這類物質(zhì)具有清熱燥濕、瀉火解毒、退虛熱之功效[5]；大豆黃卷中主要含有以大豆苷為代表的黃酮類化合物，這類物質(zhì)具有解表祛暑、清熱利濕之功效[6]。國(guó)家藥典委員會(huì)在修訂《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版時(shí)就提出，需要對(duì)盡可能多的活性成分進(jìn)行定性定量研究，加強(qiáng)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的整體研究，因此，中藥制劑多指標(biāo)成分的質(zhì)控是大勢(shì)所趨[7]。本研究建立HPLC波長(zhǎng)切換法對(duì)小兒肝炎顆粒中綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、大豆苷、梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、黃芩苷的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，為小兒肝炎顆粒的整體質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Dionex型高效液相色譜儀，包括P680A型四元梯度泵、TCC-100型柱溫箱、Chromeleon色譜工作站、PDA-100型二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Dionex公司)；CP225D型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；S180H型超聲清洗器(德國(guó)Elma公司)。

1.2 試藥

市售6批小兒肝炎顆粒，規(guī)格均為10 g/袋，分別由太極集團(tuán)四川南充制藥有限公司(批號(hào)分別為20180912、20181014、20180928)和北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠(批號(hào)分別為20181022、20180618、20180724)生產(chǎn)；對(duì)照品綠原酸(批號(hào)：110753-201817，純度：96.8%)、濱蒿內(nèi)酯(批號(hào)：111511-201704，純度：99.9%)、梔子苷(批號(hào)：110715-201821，純度：97.6%)、黃芩苷(批號(hào)：110715-201821，純度：95.4%)、鹽酸黃柏堿(批號(hào)：11895-201504，純度：94.9%)、大豆苷(批號(hào)：111738-201603，純度：93.3%)、鹽酸小檗堿(批號(hào)：110713-201814，純度：86.7%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，10%～50%A；20～45 min，50%A；45～70 min，50%～10%A)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm(0～12 min)，250 nm(12～20 min)，280 nm(20～45 min)，250 nm(45～70 min)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液制備 取綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、梔子苷、黃芩苷、鹽酸黃柏堿、大豆苷、鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇超聲處理使溶解，配制成綠原酸1 085.6 μg·mL-1、濱蒿內(nèi)酯340.2 μg·mL-1、梔子苷1 166.6 μg·mL-1、黃芩苷2 060.7 μg·mL-1、鹽酸黃柏堿492.8 μg·mL-1、大豆苷520.6 μg·mL-1、鹽酸小檗堿1 506.3 μg·mL-1混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取2 mL置50 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液制備 樣品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，室溫下超聲處理40 min后取出，放置室溫，再次精密稱定，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，即得。

2.2.3陰性樣品溶液制備 按樣品的處方比例，制備分別缺茵陳、梔子(姜炙)、黃芩、黃柏、大豆黃卷的陰性樣品溶液，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備各陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、各陰性樣品溶液10 μL，在2.1色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不低于4000；各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5；陰性樣品在各自對(duì)應(yīng)的成分上相應(yīng)的保留時(shí)間幾乎無(wú)吸收峰，表明處方中其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：A.空白溶劑；B.混合對(duì)照品溶液；C.供試品溶液(批號(hào)：20180912)；D.缺茵陳樣品溶液；E.缺梔子(姜炙)樣品溶液；F.缺黃柏樣品溶液；G.缺黃芩樣品溶液；H.缺大豆黃卷樣品溶液；1.綠原酸；2.濱蒿內(nèi)酯；3.梔子苷；4.鹽酸黃柏堿；5.黃芩苷；6.鹽酸小檗堿；7.大豆苷。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液10 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度。精密量取上述混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，在2.2項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以色譜峰峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，各成分回歸方程與線性范圍見(jiàn)表1。結(jié)果表明，綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、梔子苷、黃芩苷、鹽酸黃柏堿、大豆苷、鹽酸小檗堿在試驗(yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 小兒肝炎顆粒7個(gè)有效成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各成分峰面積的RSD。結(jié)果，綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、梔子苷、黃芩苷、鹽酸黃柏堿、大豆苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別1.2%、0.8%、1.1%、0.6%、0.9%、1.3%、1.5%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液(批號(hào)：20180912)，室溫放置，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣分析，計(jì)算各成分峰面積的RSD。結(jié)果，綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、梔子苷、黃芩苷、鹽酸黃柏堿、大豆苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.9%、1.4%、1.1%、0.7%、1.0%、1.7%、0.8%，表明供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品(批號(hào)：20180912)，按供試品制備方法平行制備6份溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各成分的含量。結(jié)果，綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、梔子苷、黃芩苷、鹽酸黃柏堿、大豆苷、鹽酸小檗堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.830 1、2.648 6、9.439 5、16.161 0、3.772 4、4.021 4、11.618 3 mg·g-1，RSD分別1.6%、0.7%、1.3%、0.9%、1.4%、0.8%、1.5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取6份2.7項(xiàng)下已知含量的供試品(批號(hào)：20180912)約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品混合儲(chǔ)備液2 mL，按供試溶液制備方法制備，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。該方法回收率良好。

表2 小兒肝炎顆粒7個(gè)有效成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測(cè)定

精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液和供試品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、梔子苷、黃芩苷、鹽酸黃柏堿、大豆苷、鹽酸小檗堿的峰面積并計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 小兒肝炎顆粒7個(gè)有效成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 提取條件的考察

試驗(yàn)考察了不同提取溶劑對(duì)色譜峰的影響[50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)、70%乙醇]，發(fā)現(xiàn)用70%甲醇和甲醇作為提取溶劑時(shí)，雜質(zhì)峰較多，分離效果不理想；用乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)作為提取溶劑時(shí)，大豆苷未檢出，且梔子苷提取效率較低；用70%乙醇作為提取溶劑時(shí)，鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿峰形欠佳，其量偏低。經(jīng)對(duì)比，用50%甲醇時(shí)，各成分含量均較高，峰形較好，故采用50%甲醇作為提取溶劑。筆者同時(shí)考察了超聲處理和加熱回流2種提取方法，發(fā)現(xiàn)2種提取方式在相同時(shí)間內(nèi)對(duì)7種成分的提取效率影響不大。本著實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便、高效的原則，筆者采用超聲(功率：250 W，頻率：33 kHz)處理樣品。另筆者分別考察了超聲處理20、30、40、60 min時(shí)7種成分的提取率，發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，7種成分的提取率呈逐增趨勢(shì)，超聲時(shí)間達(dá)到40 min以后，各組分提取率增加不明顯，且雜質(zhì)峰增多。因此，實(shí)驗(yàn)最終采用50%甲醇超聲(功率：250 W，頻率：33 kHz)40 min對(duì)樣品進(jìn)行處理。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1流動(dòng)相的選擇 筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-11]，分別以乙腈-0.02 mol·L-1醋酸銨溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、0.2%磷酸溶液-甲醇共4種流動(dòng)相進(jìn)樣分析。結(jié)果，乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，7種成分色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰分離效果最佳，基線穩(wěn)定，峰形尖銳。

3.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 筆者參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版及相關(guān)文獻(xiàn)[12-15]，最終實(shí)驗(yàn)采用波長(zhǎng)切換法，綠原酸、濱蒿內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，梔子苷、大豆苷、鹽酸小檗堿檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，鹽酸黃柏堿、黃芩苷檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，在減少波長(zhǎng)頻繁切換的同時(shí)保證了7種活性成分均能在較佳吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)。

3.3 結(jié)論

筆者通過(guò)對(duì)2個(gè)廠家6批樣品的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)各批次中7種成分雖均有檢出，但不同批次樣品中各成分含量存在一定差異，尤其是綠原酸和濱蒿內(nèi)酯含量差異較大。筆者分析可能是不同批次、不同廠家在生產(chǎn)時(shí)投入的茵陳質(zhì)量不同造成，茵陳根據(jù)采收季節(jié)和采摘部位分為“綿茵陳”和“花茵陳”，而兩者中綠原酸和濱蒿內(nèi)酯含量差異較大。綜上所述，本研究建立的HPLC波長(zhǎng)切換法在同一色譜條件下可同時(shí)測(cè)定綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、梔子苷、黃芩苷、鹽酸黃柏堿、大豆苷、鹽酸小檗堿的含量，且方法重復(fù)性好，彌補(bǔ)了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)以單一指標(biāo)黃芩苷進(jìn)行質(zhì)控的缺陷，為有效控制小兒肝炎顆粒質(zhì)量提供參考。