史國玉，周冰謙，劉偉*，王曉，耿巖玲，張琳，趙珂，李奉勝

1.山東醫(yī)學高等?？茖W校，山東 濟南 250002；2.齊魯工業(yè)大學/山東省科學院 山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；3.山東第一醫(yī)科大學 第二附屬醫(yī)院，山東 泰安 271000；4.萊蕪紫光生態(tài)園有限公司，山東 濟南 271100

白花丹參SalviamiltiorrhizaBge.F.alba為唇形科鼠尾草屬植物，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功效[1]。研究表明，白花丹參是治療高血壓、心腦血管疾病的理想藥物，且在治療血栓閉塞性脈管炎方面有獨特療效[2]。其野生種主要分布在山東泰沂山脈[3]。有研究表明，白花丹參中丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ及總丹參酮的體外抗菌活性優(yōu)于紫花丹參[4]。

隨著近年來丹參需求量的上升，其種植面積及復種指數(shù)逐年增加，引發(fā)連作障礙。這一問題已成為限制丹參種植產業(yè)發(fā)展的瓶頸[5]。研究表明，丹參連作會引起須根脫落，主根粗糙、褐變、腐爛，造成減產甚至絕產；而丹參脫落的須根產生大量的化感物質[6]，引起自毒作用，繼而影響植物生長代謝，有可能對第二年的種苗產生影響，繼而在后期產生連作障礙[7]。因此，本研究以白花丹參須根水提液為研究材料，明確其對種子萌發(fā)過程、幼苗光合作用及次生代謝產物積累的影響，以期為丹參連作障礙的消減提供理論參考。

1 材料

1.1 樣品

樣品采集于山東萊蕪紫光生態(tài)園白花丹參種植基地，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李佳教授鑒定為白花丹參SalviamiltiorrhizaBge.F.alba的種子。

1.2 儀器

722E型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；SB-3200DT型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；RXZ-280A型人工智能氣候箱(寧波江南儀器廠)；LI-6400XT型便攜式光合測定儀(北京力高泰科技有限公司)；5424型離心機(Eppendorf公司)；1200型高效液相色譜儀(包括DAD檢測器、Agilent Chemstation工作站，美國安捷倫公司)；SHZ-D(Ⅲ)型臺式真空泵(鞏義市科瑞儀器有限公司)。

1.3 試藥

牛血清蛋白(純度≥98%，美國Sigma公司)；蒽酮(純度≥99%，批號：20160324)、蔗糖(純度≥99%，批號：20150722)、甘油(純度≥99%，批號：20150212)、三氯乙酸(純度≥99%，批號：20140711)、硫代巴比妥酸(純度≥98%，批號：20190521)、乙二胺四乙酸二鈉(純度≥99%，批號：20140324)、L-甲硫氨酸(純度≥99%，批號：20190807)、核黃素(純度≥99%，批號：F20110615)、考馬斯亮藍G250(純度≥99%，批號：20190312)、巰基乙醇(批號：20200605)均購于國藥集團化學試劑有限公司；硼酸(純度≥99%，天津市廣成化學試劑有限公司)；無水乙醇(分析純，批號：20191105)、乙腈(分析純，批號：20191025)、甲醇(分析純，批號：20181201)均購于天津市富宇精細化工有限公司。

二氫丹參酮(純度≥98%，批號：B20357)、隱丹參酮(純度≥98%，批號：35825-57-1)、丹參酮Ⅰ(純度≥98%，批號：568-73-0)、丹參酮ⅡA(純度≥98%，批號：568-72-9)、丹酚酸B對照品(純度≥98%，批號：115939-25-8)均購于上海源葉生物科技有限公司；迷迭香酸(純度≥98%，批號：MUST 12020702，成都曼思特生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 白花丹參須根水提液的制備

根據(jù)前期實驗方法[6]，白花丹參收獲后收集殘留在大田中的須根，自然陰干后粉碎，過60 目篩。稱取過篩后樣品20 g，蒸餾水200 mL浸泡24 h，超聲提取0.5 h，濾過，濾渣加蒸餾水200 mL重復提取2次，合并濾液，臺式真空泵過水膜抽濾，得濾液后加蒸餾水定容至800 mL，作為白花丹參須根提取液母液。

2.2 實驗設計

種子萌發(fā)實驗共設4個處理：蒸餾水對照組(CK)、須根水提液母液處理組(A)、須根水提液1倍稀釋液處理組(B)、須根水提液2倍稀釋液處理組(C)，分別測定不同濃度白花丹參須根水提液對白花丹參種子萌發(fā)的影響。測定種子萌發(fā)后CK及C組白花丹參幼苗光合作用、生理活性及有效成分含量的影響。

2.2.1種子萌發(fā)實驗 將白花丹參種子用5%氯化汞浸泡3 min，蒸餾水徹底清洗干凈后，將種子置于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中。采用上述4種處理溶液浸濕濾紙，光照(280 μmol·m-2·s-1)14 h，恒溫25 ℃。實驗過程中保持濾紙濕潤。觀察并記錄每日的發(fā)芽數(shù)量[8]。每個處理取白花丹參種子50粒，4個重復。每天統(tǒng)計發(fā)芽情況，第四天統(tǒng)計發(fā)芽勢(GP)，第七天統(tǒng)計發(fā)芽率(GR)。

GP=[∑(G4)/N]×100%

(1)

GR=[∑(G7)/N]×100%

(2)

式中，G4為第四天的發(fā)芽數(shù)；G7為第七天的發(fā)芽數(shù)；N為供試種子數(shù)。

2.2.2丹參幼苗培養(yǎng)及光合作用的測定 將白花丹參種子用5%氯化汞浸泡3 min，蒸餾水徹底清洗干凈后置于濕潤濾紙上，放入人工智能氣候箱中萌發(fā)4～5 d。種子萌發(fā)后(以胚根突破種皮為準)，用消過毒的鑷子將其挑出，進行沙培[9]。在每盤培養(yǎng)皿(直徑15 cm)中放入洗凈的石英沙50 g及已萌發(fā)種子15粒，放入人工智能氣候箱中培養(yǎng)30 d后開始分別處理，CK加入蒸餾水5 mL繼續(xù)培養(yǎng)，C組加入白花丹參須根提取液2倍稀釋液5 mL培養(yǎng)，每個處理設置4個重復。每隔1 d各補充相應處理液2 mL，處理7 d后進行丹參幼苗光合作用的測定。

選擇生長健康的丹參功能葉片(莖尖往下第四片葉)，使用便攜式光合測定儀在自然光下對丹參幼苗葉片凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2體積濃渡進行不離體測定。

2.3 丹參幼苗生理活性的測定

2.3.1酶液提取 分別稱取丹參幼苗地上部分及地下部分0.5 g，放入預冷的研缽中，分次加入預冷的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol·L-1，pH 7.8)4 mL，在冰浴中充分勻漿。將勻漿液置于預冷離心機中10 000×g離心20 min，上清液即酶提取液[10]。

2.3.2測定方法及指標 多酚氧化酶(PPO)的活性測定參照Mishra等[11]的方法；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250法[12]；可溶性糖含量測定采用蒽酮法[13]。

2.4 丹參幼苗有效成分含量測定

根據(jù)參考文獻[14]方法測定丹參幼苗丹酚酸B、迷迭香酸、二氫丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮的含量。

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件進行處理組間差異顯著性分析，用Excel軟件處理數(shù)據(jù)并獲得標準差。

3 結果

3.1 不同濃度須根水提液對丹參種子發(fā)芽率的影響

不同濃度須根水提液對丹參種子發(fā)芽率的影響見表1。結果顯示，處理組C的GP(第四天)與GR(第七天)最高為62.25%、80.36%，較CK分別高出6.85%(P>0.05)、3.65%(P>0.05)。處理組A的丹參種子發(fā)芽勢及發(fā)芽率均為最低，分別為25.38%、71.90%，較處理組C分別低59.23%(P<0.05)、10.53%(P>0.05)。

表1 不同濃度須根水提液對丹參種子發(fā)芽率影響 %

3.2 丹參須根水提液對丹參幼苗光合作用的影響

CK中Pn、Tr、Gs分別為0.86 μmol·m-2·s-1、0.03 mmol·m-2·s-1和447.82 mmol·m-2·s-1，較C組分別高6.80%、8.06%、22.45%，而C組胞間CO2體積濃度較對照組CK高2.17%。

3.3 丹參須根水提液對丹參幼苗PPO、可溶性糖及可溶性蛋白的影響

分別對丹參幼苗地上及地下部分進行PPO活性和可溶性糖、可溶性蛋白含量進行分析(表2)。結果顯示，CK中PPO活性和可溶性蛋白、可溶性糖總量分別較C組低7.86%(P>0.05)、8.47%(P<0.05)、14.33%(P>0.05)。其中，PPO活性和可溶性蛋白、可溶性糖總量在2個組中均表現(xiàn)為地上部分高于地下部分。

表2 須根提取液對丹參幼苗PPO活性和可溶性糖、可溶性蛋白質量分數(shù)

3.4 丹參須根水提液對丹參幼苗有效物質含量的影響

表3顯示，處理組C中丹參幼苗的丹酚酸B及迷迭香酸總含量較CK分別高出46.84%(P<0.05)、9.77%(P<0.05)；地下部分丹酚酸B及迷迭香酸含量CK分別較處理C低33.83%、21.00%。丹參須根水提液對丹參幼苗脂溶性成分含量的影響見圖1。由圖1可以看出，處理組C中丹參幼苗含量高于CK，二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮 Ⅰ 及丹參酮 ⅡA分別較對照組高出249.87%(P<0.01)、289.32%(P<0.01)、40.21%(P<0.05)及17.22%(P>0.05)。

表3 丹參幼苗水溶性成分質量分數(shù) %

圖1 丹參須根水提液2倍稀釋液對丹參幼苗脂溶性成分質量分數(shù)的影響

4 討論

植物根系有吸收水分和營養(yǎng)的功能，同時也分泌各種化學物質產生自毒作用[15]，即植物自身的分泌物，如莖、葉的淋溶及殘體分解物、根系分泌物等所產生的有毒物質抑制植物生長的現(xiàn)象[16]，酚類化合物作為化感物質中最為常見的分泌物，對植物的種子萌發(fā)有著明顯的抑制作用。而種子萌發(fā)是植物生活史的重要階段之一，是決定著藥材產量和質量的第一個關鍵因素[17]，因此研究化感物質對種子萌發(fā)及幼苗生長的影響具有重要的作用。

研究報道表明，多種植物提取液中含有阿魏酸、香豆素等酚酸類物質，如小麥、黑胡桃、燕麥及黃花茅等，這些植物中含有的化感物質能對牽牛花、雜草種子的萌發(fā)有明顯的抑制作用[18-21]。而丹參須根提取液中含有的酚酸類物質對丹參產量及質量的形成也有著不同程度的影響[6-7]。本研究中以不同濃度的丹參須根水提液對其種子萌發(fā)、幼苗光合作用、生理活性及有效成分含量的影響進行研究，發(fā)現(xiàn)不同濃度的參須根水提液對其種子萌發(fā)的影響呈現(xiàn)出顯著的“劑量效應”，即高濃度抑制種子萌發(fā)，低濃度促進種子萌發(fā)的現(xiàn)象，這可能與化感物質影響種子中相關酶合成及活性有關，如硝酸還原酶、淀粉酶、磷酸化酶等，同時抑制細胞分裂及伸長等生理過程，影響蛋白的合成及基因表達改變激素水平從而使得種子萌發(fā)所需要的能量及物質得不到有效供給，因此造成了種子的活力降低，萌發(fā)率下降等[17，22]。同時，須根水提液對種皮的滲透壓也有一定影響，造成吸水力作用的紊亂，這些物質同時也能滋生病原微生物的生長，造成種子腐爛，抑制種子萌發(fā)[23-24]。

另外，PPO可將植物體內的酚類物質氧化成對病原菌有毒的醌類物質，并具有清除H2O2的作用，其活性與植物抗逆密切相關[25]。因此，本研究中丹參在重茬逆境下啟動其自身防御機制，使得體內PPO酶活性升高。同時，PPO參與有機物中芳香族化合物的轉化，這可能與須根提取液中所含的酚酸類物質的積聚導致底物誘導相應功能酶的活性有關[26]。