楊揚宇，陳林，唐雪陽，蔡萍，唐正平，張水寒*

1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；3.湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司，湖南 瀏陽 410300

百合為百合科百合屬植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.、百合L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker 或細(xì)葉百合L.pumilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉[1]，具有滋陰清肺、化痰止咳、寧心安神的功效，收載于《中華人民共和國藥典》2015年版，是最具代表性的藥食兩用中藥之一[2]。百合主要含有酚性甘油酯、多糖、生物堿、甾體皂苷類等活性成分。與多糖、皂苷類相比，酚性甘油酯類含量相對較低，卻是百合發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用的重要活性成分，與百合養(yǎng)肺陰、補肺氣功效緊密相關(guān)[3-7]?；趫F隊前期研究發(fā)現(xiàn)，王百合苷類物質(zhì)含量在炮制前后的百合中差異有統(tǒng)計學(xué)意義[8]。此外，據(jù)文獻(xiàn)報道，這一類成分的含量與百合品種和產(chǎn)地等因素均有一定關(guān)系[3，9]，其中，報道較多的酚性甘油酯類包括王百合苷B、王百合苷C、王百合苷E、王百合苷F、1-O-阿魏酰甘油等。這些成分或可作為鑒別不同品種和產(chǎn)區(qū)百合的關(guān)鍵成分。利用中藥指紋圖譜作為質(zhì)量控制指標(biāo)的方法，分析不同產(chǎn)地的多個樣本，可以有效控制百合藥材質(zhì)量[9-12]。本研究建立了百合高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，同時針對百合中3種酚性甘油酯成分進(jìn)行含量測定，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析，評價我國百合藥材主產(chǎn)地湖南、江西、安徽等地栽培品種的質(zhì)量，為百合質(zhì)量控制與開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LC-20AT型高效液相色譜儀，包括SPD-M20A型二極陣列檢測器、SIL-20A型自動進(jìn)樣器、CTO-10AS VP型柱溫箱[島津儀器(中國)有限公司]；AL204型電子天平、XPE105型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試藥

采集了21份百合樣本，并經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究所劉浩助理研究員鑒定為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.的干燥肉質(zhì)鱗葉，憑證標(biāo)本存放于湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所。樣品產(chǎn)地信息見表1。

表1 21批百合樣品信息

對照品王百合苷C(純度：99.9%，批號：P20D10F106515)、王百合苷E(純度：99.2%，批號：P08J11F107953)、王百合苷B(純度：99.6%，批號：P28S10F99182)均購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜純，美國天地有限公司)；磷酸(分析純，天津市恒興化學(xué)試劑)；甲醇(分析純，湖南匯虹試劑有限公司)；純凈水(華潤怡寶飲料有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動相：乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)梯度洗脫(0～2 min，5%～13%A；2～17 min，13%～15%A；17～37 min，15%～20%A；37～42 min，20%～100%A)；流速：1 mL·min-1；檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1對照品溶液的制備 取王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B對照品適量，精密稱定，分別置于量瓶中，加80%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為521、499、1046 μg·mL-1的對照品儲備液。

2.2.2供試品溶液制備 取21批次的樣品粉末(過四號篩)約 1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80% 甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理 30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗 取百合供試品(S10)溶液，按2.1項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。以26號王百合苷E色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間 RSD 均小于 1%，相對峰面積 RSD 均小于 3%。表明儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗 取百合供試品(S10)溶液，按2.1項下色譜條件分別在 0、1、2、4、8、12 h 進(jìn)樣分析。以 26 號王百合苷E色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間 RSD 均小于 1%，相對峰面積 RSD 均小于 3%。表明供試品溶液的成分在室溫放置在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性試驗 平行取百合供試品(S10)6 份，按2.2項下供試品溶液的配制方法處理，按2.1項下色譜條件測定。以 26 號王百合苷E色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰相對保留時間 RSD 均小于 1%，相對峰面積RSD 均小于3%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項下王百合苷C、王百合苷E對照品儲備液0.1、0.3、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置于10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取2.2.1項下王百合苷B對照品儲備液 0.1、1.0、1.9、2.8、3.7、4.6、5.5 mL分別置于10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻。按2.1項下色譜條件依次進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積，以各對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，其所對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，各成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表2。結(jié)果表明，王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B質(zhì)量濃度分別為5.21～104.20、4.99～99.8、10.46～575.30 μg·mL-1時呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表2 3種王百合苷含量線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.5加樣回收率試驗 平行稱取1 g已知含量的樣品(S10)9份，精密稱定，按已知含量的50%、100%、150% 3個水平精密加入對照品，按2.2.2項下方法制備，配制成低、中、高 3個不同質(zhì)量濃度的供試品溶液，每個質(zhì)量濃度制備3份，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析。計算王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B的平均回收率分別為 101.4%、97.9%、99.2%，RSD分別為 3.82%、1.96%、2.77%。說明該方法的準(zhǔn)確性良好。

2.4 百合藥材含量測定

按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下的色譜條件對不同產(chǎn)地的21份百合供試品溶液進(jìn)樣分析，計算王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測定結(jié)果見表3。王百合苷C平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.185±0.052)mg·g-1，以安徽產(chǎn)最高，河北產(chǎn)最低；王百合苷E平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.203±0.054)mg·g-1，以安徽產(chǎn)最高，陜西產(chǎn)最低；王百合苷B平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(1.956±0.438)mg·g-1，以江西和安徽產(chǎn)較高，陜西產(chǎn)最低。

表3 21批百合藥材中王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B含量測定結(jié)果(n=3) mg·g-1

2.5 百合藥材指紋圖譜的建立與分析

2.5.1指紋圖譜共有峰確定 取21批百合藥材樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下確定的色譜條件進(jìn)樣測定，得到百合藥材及對照品溶液圖譜(圖1)，使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012版)”對 21 批百合藥材特征圖譜進(jìn)行共有峰標(biāo)識(圖2)，共標(biāo)識了31個共有峰，并生成對照圖譜(圖3)。

注：A.王百合苷C；B.王百合苷E；C.王百合苷B；D.百合藥材；E.空白對照。

圖2 21批百合藥材HPLC指紋圖譜疊加圖

圖3 百合藥材HPLC對照圖譜

2.5.2指紋圖譜相似度評價結(jié)果 以21批百合藥材樣品生成的共有模式(R)為對照指紋圖譜，21批次百合藥材與對照指紋圖譜的相似度分別為0.970、0.986、0.972、0.982、0.990、0.971、0.986、0.973、0.899、0.890、0.925、0.988、0.975、0.988、0.979、0.980、0.977、0.992、0.939、0.925、0.974。相似度結(jié)果表明，21批百合指紋圖譜相似度存在一定差異，S9、S10 2批陜西產(chǎn)百合相似度匹配較低，其他各批次相似度均在0.900以上，需結(jié)合其他化學(xué)計量學(xué)方法進(jìn)一步分析以評價不同產(chǎn)地百合質(zhì)量。

2.5.3不同產(chǎn)地百合主成分分析(PCA)PCA方法是一種無監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法[13-14]，能夠從原始數(shù)據(jù)中提取共有特征并構(gòu)建成主成分因子；通過主成分因子可以體現(xiàn)樣本間相似性和原始數(shù)據(jù)對主成分因子的貢獻(xiàn)。本研究以31個共有峰的峰面積為變量，用SPSS 24.0.0.0軟件對21份不同產(chǎn)地的百合進(jìn)行PCA，特征值及方差貢獻(xiàn)率見表4，碎石圖見圖4。前3個成分的累積方差貢獻(xiàn)率為76.46%，表明前3個主成分能夠充分體現(xiàn)出百合的基本特征和主要信息。結(jié)合觀察碎石圖可見PCA中特征值的變化情況，圖中曲線存在1個明顯的拐點，說明前3個主成分的分析結(jié)果基本顯示出了不同批次百合藥材之間的相似度和差異性。

表4 百合PCA特征值和方差貢獻(xiàn)率

圖4 百合PCA碎石圖

初始因子載荷矩陣見表5。第一主成分主要反映了來自原始指標(biāo)色譜峰1～2、4～8、10、12～14、10、16～17、19、23～25的信息，第二主成分主要反映了來自原始指標(biāo)色譜峰20、22、26～28、30的信息，第三主成分主要反映來自原始指標(biāo)色譜峰21、29的信息。初始因子載荷矩陣結(jié)果顯示，王百合苷C對主成分1的載荷值達(dá)到0.708，王百合苷E和王百合苷B對主成分2的載荷值分別為0.625、0.748，表明王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B在特征變量的重要性評估中具有優(yōu)勢，對百合不同批次間的差異成分有一定貢獻(xiàn)，這與其他團隊研究結(jié)果相符合[3]。

表5 百合PCA主要因子載荷矩陣

2.5.4不同產(chǎn)地百合隨機森林分析 采用有監(jiān)督的隨機森林算法(RFA)[8]，以湖南省為一類，而其他省份為一類進(jìn)行聚類分析，分析結(jié)果見圖5。由圖5可知，來自湖南省的樣本聚集在分類圖的右下角，而其他省份百合聚集在分類圖的上部，RFA對不同省份百合的分類準(zhǔn)確率達(dá)到85.71%。說明結(jié)合HPLC指紋圖譜與模式識別分析，可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地百合樣本的差異性，為百合質(zhì)量評價及分析提供參考。

圖5 采用RFA的百合樣本聚類分析

3 討論

3.1 色譜條件確定

本實驗對色譜條件中的流動相體系(乙腈-水、甲酸-水、乙腈-磷酸水、乙腈-甲酸水)、檢測波長(210～350 nm)進(jìn)行考察。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.3%磷酸體系對各色譜峰分離效果最好，選擇了250 nm作為百合藥材指紋圖譜和含量測定波長。對洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，最終建立了簡便可行的分析方法。

3.2 供試品溶液制備方法確定

在供試品溶液的制備方法方面，考察了提取溶劑(50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇)、提取方式(超聲、回流)、提取倍量(10、20、30倍)和提取時間(10、20、30 min)，優(yōu)選出百合藥材的最佳提取方式，即80%甲醇10倍量，超聲提取30 min，可將百合藥材中3種酚性甘油酯成分完全提取，所建立的提取方法穩(wěn)定、合理。

4 結(jié)語

目前，對百合指紋特征圖譜的研究主要通過儀器分析，圍繞百合的品種、產(chǎn)地、炮制加工等因素對藥材質(zhì)量的影響進(jìn)行評價，但評價方式較為單一。本研究利用HPLC指紋圖譜形成不同產(chǎn)地百合共有識別模式，表征共有酚性甘油酯成分王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B含量，21批百合對照圖譜相似度存在一定差異。在此基礎(chǔ)上，運用PCA、RFA對百合樣品信息進(jìn)行深挖。PCA對于指紋圖譜類復(fù)雜數(shù)據(jù)有化繁為簡的降維作用。分析結(jié)果表明，王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B對百合質(zhì)量特征有一定貢獻(xiàn)，進(jìn)一步采用RFA發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地百合樣本差異。本研究建立的基于HPLC指紋圖譜和化學(xué)計量學(xué)分析的百合質(zhì)量評價方式，為不同產(chǎn)地百合差異與質(zhì)量分析提供依據(jù)，為全面評價百合藥材的質(zhì)量提供了一種切實可行的參考。