李晴霞，康念欣，袁炎炎，劉永剛，譚鵬

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種消化系統(tǒng)常見的難治性、非特異性慢性炎癥性腸道炎癥疾病，病變主要位于結(jié)腸的黏膜層，以潰瘍?yōu)橹?，大多會涉及直腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸，也可能會向近端擴(kuò)展，導(dǎo)致潰瘍遍布整個結(jié)腸。UC以腹瀉、腹痛、血便為主要臨床癥狀，其病因較為復(fù)雜，尚未完全闡明。目前，UC的發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為與飲食、腸道微生物結(jié)構(gòu)、遺傳等多種因素有關(guān)，但中醫(yī)認(rèn)為其多由脾胃功能失調(diào)、濕熱內(nèi)蘊(yùn)，與氣血搏結(jié)、化為膿血所致，與中醫(yī)學(xué)中的“痢疾”“腸癖”相近[1]。UC主要發(fā)生在30～40歲，其治療難度較大、易反復(fù)發(fā)作，病程可長達(dá)幾十年甚至伴隨終生[2]。UC患者由于慢性炎癥反復(fù)發(fā)作，結(jié)腸癌的患病概率也逐漸升高，病程30年的UC患者結(jié)腸癌變的幾率達(dá)到30%[3-4]。越來越多的研究表明，UC的常規(guī)化學(xué)藥物治療效果不夠理想，而中藥的優(yōu)勢在于能夠控制其發(fā)作次數(shù)和間隔時間，緩解患者的臨床癥狀[5]。

甘草是豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的根及根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳等功效[6]。研究表明，甘草除具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用外，還具有抗?jié)兊淖饔肹7]。有學(xué)者統(tǒng)計(jì)了治療UC的中藥，頻次最高的前3味中就有甘草[8]。Takhshid等[9]研究表明，甘草提取物可降低結(jié)腸炎性反應(yīng)和水腫。Liu等[10]研究表明，甘草對UC具有抗炎的作用。目前，主要是從單一成分或單一靶點(diǎn)對甘草治療UC的作用機(jī)制進(jìn)行研究。中藥是通過多成分作用于多靶點(diǎn)，調(diào)控多條通路來達(dá)到治療疾病的目的，從單一方面研究很難闡明其作用的整體性與系統(tǒng)性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種研究傳統(tǒng)藥物的新模式，以計(jì)算機(jī)技術(shù)為基礎(chǔ)，將系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)的方法加以整合，探討中藥活性成分、靶點(diǎn)、生物學(xué)通路及疾病之間的關(guān)系，從而在整體水平上闡明中藥藥效的作用機(jī)制。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過建立“成分-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)，從整體角度探討甘草治療UC的作用機(jī)制，為甘草治療UC的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 甘草入血活性成分篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)，以“甘草”為關(guān)鍵詞檢索，得到甘草中的化學(xué)成分，再以口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18為條件篩選活性成分。

1.2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過TCMSP查詢篩選出的化合物作用靶點(diǎn)。所得的靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫，使用UniProtKB查詢靶蛋白對應(yīng)靶基因的規(guī)范名稱。將成分-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)信息上傳到 Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建甘草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 UC蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過CTD(comparative toxicogenomics database)數(shù)據(jù)庫找出與UC相關(guān)的基因。采用Venny 2.1軟件選取甘草活性成分作用靶點(diǎn)與UC相關(guān)基因的交集，上傳至在線STRING 10.0軟件，得到交集蛋白之間的PPI數(shù)據(jù)。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將篩選出的交集蛋白導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，利用軟件中的ClueGO插件進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.5 成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的交集蛋白及相關(guān)聯(lián)的甘草成分相互作用信息上傳到Cytoscape 3.7.2 軟件中，構(gòu)建與UC相關(guān)的甘草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。再將篩選出的交集蛋白與KEGG富集得到的信號通路關(guān)聯(lián)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建出UC相關(guān)靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Merge 功能將以上2種網(wǎng)絡(luò)合并，得出成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 甘草入血活性成分篩選

利用TCMSP篩選出甘草入血活性成分共92種，見表1(僅列出其中20項(xiàng))。

表1 甘草部分活性成分

2.2 甘草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用TCMSP查詢與活性成分相關(guān)的靶蛋白，并使用UniProtKB查詢出靶蛋白對應(yīng)靶基因的規(guī)范名稱，部分活性成分的靶點(diǎn)信息見表2。最終將成分-靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，得出甘草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中共有319個節(jié)點(diǎn)、1765條邊。甘草中共篩選出92個化合物。與節(jié)點(diǎn)相連的邊越多，節(jié)點(diǎn)的度值越高。度值較高的節(jié)點(diǎn)位于網(wǎng)絡(luò)中心，在網(wǎng)絡(luò)中的作用較強(qiáng)，該節(jié)點(diǎn)的形狀也相應(yīng)較大。其中槲皮素有152個作用靶點(diǎn)，芒柄花黃素有39個作用靶點(diǎn)。此外，網(wǎng)絡(luò)中度值較高的成分還有山柰酚、異鼠李素、柚皮素等。這些具有較多靶點(diǎn)的成分可能是甘草發(fā)揮藥理作用的核心成分。從甘草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中可以得出，甘草是通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮藥理作用，符合中藥治療疾病的系統(tǒng)性和整體性。

表2 甘草活性成分部分靶點(diǎn)信息

注：綠色四邊形代表甘草活性成分；紫色圓形代表作用靶點(diǎn)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在CTD數(shù)據(jù)庫中輸入疾病名稱“潰瘍性結(jié)腸炎”，找出UC相關(guān)的蛋白114個。其中41個與甘草成分作用靶點(diǎn)相同，為甘草成分作用靶點(diǎn)與UC相關(guān)蛋白的交集蛋白。將41個交集蛋白上傳至在線STRING 10.0軟件，得到交集蛋白之間的相互作用關(guān)系。將相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖中包括41個交集蛋白節(jié)點(diǎn)(藍(lán)色六邊形)及535條邊。由圖2可以看出，與其他靶點(diǎn)有較多相互作用的靶點(diǎn)為腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)及血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)等。

2.4 KEGG通路富集分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件中ClueGO插件對甘草作用靶點(diǎn)與UC相關(guān)蛋白的交集蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析。將所涉及的41種蛋白質(zhì)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，通過KEGG富集分析探討甘草治療UC所涉及的信號通路。通過分析發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)共涉及IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、阿米巴病(Amoebiasis)信號通路、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)通路、癌癥信號通路(pathways in cancer)、流體剪切力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等28條信號通路。這些信號通路與UC密切相關(guān)，具體信息見圖3。

注：基因數(shù)表示導(dǎo)入的基因與該信號通路相關(guān)的個數(shù)；柱上的數(shù)字表示與該信號通路相關(guān)的導(dǎo)入基因占所有與該信號通路相關(guān)基因的百分比。

2.5 成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Merge 功能將甘草活性成分與交集蛋白及代謝通路之間相互作用關(guān)系合并，構(gòu)建出甘草活性成分-作用靶點(diǎn)-代謝通路網(wǎng)絡(luò)，見圖4。圖4中包括甘草活性成分84種、UC相關(guān)靶點(diǎn) 41個、信號通路28條。篩選出的甘草活性成分的作用靶點(diǎn)分布在不同的信號通路，相互協(xié)調(diào)，通過調(diào)控不同的信號通路發(fā)揮治療UC的作用。成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)顯示，甘草中有槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素、異鼠李素等84個活性成分與TNF、IL-6、MAPK3、VEGFA、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、一氧化氮合酶2(NOS2)、過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARG)、糖原合成酶激酶-3β(GSK3B)等41個UC相關(guān)蛋白存在較強(qiáng)的相互作用。通過網(wǎng)絡(luò)富集發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)主要集中在IL-17信號通路、阿米巴病信號通路及炎癥性腸病通路等28條信號通路，參與調(diào)控UC病理過程的不同環(huán)節(jié)。

注：粉紅色四邊形代表甘草活性成分；綠色圓形代表共有靶點(diǎn)；淡藍(lán)色矩形代表信號通路。

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步建立了甘草治療UC的成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)通路網(wǎng)絡(luò)。利用TCMSP、CTD等數(shù)據(jù)庫研究發(fā)現(xiàn)，甘草中共含有92個活性成分，存在227個靶點(diǎn)。這227個靶點(diǎn)中共有41個靶點(diǎn)與UC相關(guān)，而92種化學(xué)成分中有84種與UC相關(guān)。將與UC相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)涉及28條生物學(xué)通路，參與調(diào)控UC病理過程的不同環(huán)節(jié)。

通過分析成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測甘草中參與治療UC的化學(xué)成分為槲皮素、芒柄花黃素、山柰酚、異鼠李素、柚皮素等84個成分。相關(guān)研究表明，槲皮素可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放及阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子通路的激活而有效抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而治療UC[11]；芒柄花黃素可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)的表達(dá)防止UC的發(fā)生[12]。這84個活性成分與41個UC相關(guān)蛋白存在較強(qiáng)的相互作用，通過網(wǎng)絡(luò)富集發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)主要集中在IL-17、炎癥性腸病通路及阿米巴病信號通路等28條信號通路。Ogawa等[13]研究發(fā)現(xiàn)，阻斷體內(nèi)IL-17活性可增強(qiáng)小鼠UC的發(fā)展，表明IL-17在UC發(fā)展中具有抑制作用。另有研究表明，炎癥性腸病可增加大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，包括2種主要的亞型，即UC和克羅恩病[14-15]。由此可知，甘草中多種成分通過作用于多個靶點(diǎn)、調(diào)控多條生物學(xué)通路發(fā)揮治療UC的作用，這也體現(xiàn)出中藥治療疾病的整體性與系統(tǒng)性。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度出發(fā)，初步闡述了甘草治療UC的潛在活性成分、可能作用的靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的生物學(xué)通路，初步揭示了甘草治療UC的相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究其藥理作用機(jī)制提供參考。本研究只是通過數(shù)據(jù)挖掘?qū)Ω什葜委烾C的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測，還需要通過藥理和臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。