王少平，趙一慕，李盼盼，宋書祎，韓菲，張加余，代龍

濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003

土鱉蟲，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有破血逐瘀、續(xù)筋接骨的功效，主治血積癥瘕、破堅、下血閉等證[1]?，F(xiàn)代臨床其多用于高血脂、非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化等心血管疾病的治療。對土鱉蟲化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其含有氨基酸、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油、脂肪酸及微量元素等成分[2-4]。

心腦血管疾病泛指由高脂血癥、動脈粥樣硬化、高血壓等疾病所導(dǎo)致的心臟、大腦及全身組織發(fā)生的缺血性或出血性病變[5]。據(jù)統(tǒng)計，每年全世界死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1300萬人，死亡率居各種疾病首位。中醫(yī)認(rèn)為心血管疾病的主要病機(jī)是痰阻血凝、機(jī)體氣血失調(diào)、血運(yùn)受阻所致。土鱉蟲具有破血逐瘀的療效，是治療此類疾病的有效藥物[6-9]，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制至今尚不明確。因此，分析土鱉蟲的有效活性成分和作用靶點(diǎn)、揭示其可能的作用機(jī)制具有現(xiàn)實意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為近年出現(xiàn)的一門新興技術(shù)，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，從多成分、多靶點(diǎn)的研究策略出發(fā)，實現(xiàn)藥物作用機(jī)制的綜合網(wǎng)絡(luò)分析[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)藥理論具有高度一致性，目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被廣泛用于中藥潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的預(yù)測及中藥作用機(jī)制的闡述。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性角度預(yù)測土鱉蟲破血逐瘀的作用機(jī)制，為土鱉蟲臨床使用提供參考。

1 材料

1.1 藥材與試劑

土鱉蟲，購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院林鶯教授鑒定為鱉蠊科中華冀土鱉Steleophagaplancyi(Boleny)的雌蟲；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，硫酸銨、石油醚、正丁醇(分析純，天津富宇化工廠)；去離子水(杭州娃哈哈純凈水有限公司)；1000 Da納濾膜(美國GE公司)。

1.2 儀器

HH-601型超級恒溫水浴鍋(鎮(zhèn)江瑞祥儀器有限公司)；HT52型臺式高速離心機(jī)(上海安亭精密儀器有限公司)；TGH21型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化精密儀器有限公司)；M22型冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)儀器設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 土鱉蟲活性成分及靶點(diǎn)的篩選

通過檢索中國知網(wǎng)(CNKI)、維普、萬方、Web of Science(http：//www.wokinfo.com/)、PubMed(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)等相關(guān)國內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫查閱與土鱉蟲相關(guān)文獻(xiàn)，并結(jié)合PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和SwissADME(http：//www.swissadme.ch)等數(shù)據(jù)庫，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為閾值得到土鱉蟲的活性成分。采用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swiss.ch)和TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)對所得成分的對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。

2.2 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述獲得的活性成分及靶點(diǎn)關(guān)系導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.2.1進(jìn)行構(gòu)建和分析，完成“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。以“節(jié)點(diǎn)”(node)表示分子和靶蛋白，“邊”(edge)表示成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系，表述網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵傩浴?/p>

2.3 相關(guān)疾病靶點(diǎn)檢索及土鱉蟲破血逐瘀靶點(diǎn)的預(yù)測

基于中醫(yī)對心腦血管疾病的認(rèn)識，結(jié)合西醫(yī)臨床心腦血管疾病的表現(xiàn)，共篩選出高血壓、高血脂、彌漫性血栓等與中醫(yī)“破血逐瘀”有關(guān)的17種疾病，采用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//www.omim.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http：//db.idrblab.net/ttd/)、HPO數(shù)據(jù)庫(https：//hpo.jax.org/)檢索每個疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，整合重復(fù)靶點(diǎn)后得到“破血逐瘀”的作用靶點(diǎn)。

采用Draw Venn Diagram數(shù)據(jù)庫(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對已知土鱉蟲活性成分的靶點(diǎn)和“破血逐瘀”的作用靶點(diǎn)進(jìn)行交互分析，得出交互靶點(diǎn)，作為土鱉蟲發(fā)揮破血逐瘀作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

借助STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，將集合靶點(diǎn)映射到PPI網(wǎng)絡(luò)中。基于數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)Dgreement(D值)、Betweenment(B值)和Clossment(C值)等參數(shù)，結(jié)合相關(guān)系數(shù)P<0.05篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

將交互靶點(diǎn)采用Cytoscape 3.7.1軟件的ClueGO分析插件和FUNRich 3.6.3軟件、DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO、KEGG分析，并以P<0.01為閾值，篩選出土鱉蟲破血逐瘀功效所涉及的生物功能。

2.6 土鱉蟲不同組分體外藥效實驗

2.6.1土鱉蟲總蛋白制備 取土鱉蟲藥材2 kg，粉碎過100目篩，加3倍量pH 7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，在37 ℃下溫浸提取1.0 h，4500 r·min-1離心10 min(離心半徑為10 cm)得上清液。4 ℃冷藏處理12 h 后5000 r·min-1離心10 min(離心半徑為10 cm)除去沉淀，上清液加硫酸銨至濃度為20%，繼續(xù)放置于4 ℃冷藏處理12 h，4500 r·min-1離心10 min(離心半徑10 cm)，留取沉淀；沉淀加10倍量去離子水溶解后過1000 Da納濾膜除去硫酸銨。大分子溶液冷藏于-80 ℃冰箱12 h，采用冷凍干燥機(jī)干燥既得土鱉蟲總蛋白。

2.6.2土鱉蟲脂肪油制備 取土鱉蟲藥材500 g，粉碎過100目篩，加5倍量沸程為60～90 ℃的石油醚，回流提取4.0 h。3500 r·min-1離心10 min(離心半徑為10 cm)獲得石油醚提取液，40 ℃下減壓回收石油醚，即得土鱉蟲脂肪油。

2.6.3土鱉蟲總核苷和總多糖提取 依據(jù)文獻(xiàn)方法[11]對土鱉蟲總核苷和總多糖進(jìn)行提取，得到土鱉蟲總核苷溶液和總多糖溶液。

2.6.4體外纖溶實驗 取磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉適量，配制成pH=7.25的PBS，PBS和0.9%氯化鈉溶液按照1∶17混合制成工作液，再取纖維蛋白原適量，采用工作液溶解配制成0.03 g·L-1溶液，取工作液加熱至沸騰后加入預(yù)先稱好的瓊脂糖，配制成0.5%瓊脂糖溶液。在此期間采用0.9%氯化鈉溶液配制10 U·mL-1的凝血酶溶液，完全溶解后的瓊脂糖溶液冷卻至50 ℃，迅速加入纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液，導(dǎo)入培養(yǎng)皿內(nèi)。打孔，放入冰箱凝固后備用。以不同活力尿激酶溶液作為對照品，以活力對數(shù)為橫坐標(biāo)，以溶圈面積為縱坐標(biāo)繪制曲線。

3 結(jié)果

3.1 土鱉蟲活性成分篩選及作用靶點(diǎn)的預(yù)測

通過對現(xiàn)有文獻(xiàn)中已報道的土鱉蟲成分進(jìn)行系統(tǒng)整理[12-14]，結(jié)合數(shù)據(jù)庫共搜集到成分108個。經(jīng)SwissADME數(shù)據(jù)庫的“GI absorption”功能對其進(jìn)行篩選共獲得入血成分54個，多為小分子脂肪酸、核苷和氨基酸類成分，結(jié)果見表1。利用SwissTargetPrediction等數(shù)據(jù)庫對54種入血成分進(jìn)行作用靶點(diǎn)預(yù)測，合并重復(fù)靶點(diǎn)共獲得相關(guān)靶點(diǎn)653個。

表1 土鱉蟲活性成分篩選

3.2 土鱉蟲“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

將上述活性成分及預(yù)測靶點(diǎn)導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.2.1進(jìn)行關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的繪制和分析，見圖1。通過網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建共獲得693個節(jié)點(diǎn)和3240個邊。

注：紅色菱形為土鱉蟲活性成分；黃色橢圓形為成分作用靶點(diǎn)。

3.3 土鱉蟲治療破血逐瘀相關(guān)疾病靶點(diǎn)

經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢與破血逐瘀相關(guān)的18種疾病，采用GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取與破血逐瘀相關(guān)作用靶點(diǎn)共16 141個，建立疾病靶點(diǎn)庫。并將疾病靶點(diǎn)與土鱉蟲活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行交互分析，得到土鱉蟲治療破血逐瘀相關(guān)疾病的靶點(diǎn)共26個，結(jié)果見表2和圖2。

表2 土鱉蟲治療破血逐瘀相關(guān)疾病靶點(diǎn)

圖2 土鱉蟲治療破血逐瘀相關(guān)靶點(diǎn)

3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫對交互靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，結(jié)果表明，26個靶點(diǎn)之間聯(lián)系性并不緊密，共獲得26個節(jié)點(diǎn)和26條邊。而機(jī)體的內(nèi)在調(diào)控往往不是單一信號通路支配，而是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而PPI數(shù)據(jù)為尋找靶點(diǎn)的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系提供了可能。PPI的結(jié)果表明，目前已知的土鱉蟲入血成分所對應(yīng)靶點(diǎn)并不能完全反映土鱉蟲的功效(圖3)。

圖3 土鱉蟲活性成分破血逐瘀靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

3.5 土鱉蟲破血逐瘀可能的機(jī)制分析

對交互靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。細(xì)胞組分(cell component，CC)分析得出土鱉蟲入血成分可影響細(xì)胞膜內(nèi)外通透性、細(xì)胞核DNA表達(dá)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞顆粒狀因子釋放、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)環(huán)境變化等40種組分，其中對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體影響為主。表明土鱉蟲可干預(yù)細(xì)胞因子釋放以及DNA轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)對疾病的治療作用。分子功能(molecular function，MF)分析得出土鱉蟲已知成分主要涉及氧化還原酶、絲氨酸肽酶、半胱氨酸型肽酶、磷酸二酯水解酶、天冬氨酸型信號肽酶和裂解酶等10個分子活化與裂解功能。生物過程(biological process，BP)分析得出土鱉蟲已知成分主要涉及機(jī)體的蛋白質(zhì)代謝、能量代謝、細(xì)胞生長運(yùn)輸、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等9個生物功能(圖4)。

注：A.CC分析；B.MF分析；C.BP分析。

CC、MF和BP結(jié)果充分揭示了土鱉蟲已知成分可以通過影響細(xì)胞膜外環(huán)境使細(xì)胞膜表面相應(yīng)受體得到感知，激活相關(guān)分子的活動來干預(yù)相關(guān)基因的表達(dá)；細(xì)胞核內(nèi)DNA連同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體等眾多細(xì)胞器通過產(chǎn)生相關(guān)因子、吞噬細(xì)胞或細(xì)胞微粒等來改變細(xì)胞質(zhì)的組成，進(jìn)而影響機(jī)體的代謝過程。但以上結(jié)果不能完全表示土鱉蟲直接作用的途徑，因此需聯(lián)合KEGG信號通路分析結(jié)果來具體闡釋。

采用KEGG數(shù)據(jù)庫、DAVID數(shù)據(jù)庫、Cytoscape 3.7.1軟件和FUNRich軟件對交互靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析(圖5)。通過KEGG富集分析得出土鱉蟲已知成分通過50條通路途徑治療心血管疾病，主要涉及嘌呤代謝通路、細(xì)胞能量代謝通路、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)信號通路、Toll樣受體信號通路、醛固酮合成代謝通路、三酰甘油合成通路等。以P<0.05位閾值進(jìn)行分析，得出主要生物信號通路13條，將13條主要信號通路的對應(yīng)靶點(diǎn)與土鱉蟲已知成分的相應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行交互分析，結(jié)果表明，土鱉蟲中的54個成分中只有39個成分對心血管疾病具有潛在作用，而39個成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)未全部反映在13條主要通路上。結(jié)合PPI分析和GO分析結(jié)果，說明目前土鱉蟲已知成分并不能很好地治療心血管疾病。

圖5 土鱉蟲破血逐瘀的通路-成分-靶點(diǎn)富集分析

3.6 體外纖溶活性實驗結(jié)果

以不同活力尿激酶為對照溶液，以活力對數(shù)為橫坐標(biāo)，以溶圈面積為縱坐標(biāo)繪制曲線(圖6)。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.577 4X-1.873 6，r=0.998 4，線性關(guān)系良好。

體外纖溶活性實驗結(jié)果(圖6)表明，土鱉蟲水溶性蛋白纖溶活性較其他成分強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果說明土鱉蟲蛋白可能是其活血化瘀功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

注：A.體外纖溶標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.體外纖溶活性；**P<0.01。

4 討論

本實驗對土鱉蟲主要活性成分、生物功能以及作用信號通路進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究分析，結(jié)合OB和DL，篩選出土鱉蟲與破血逐瘀相關(guān)的活性成分共54個。利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建土鱉蟲“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，揭示土鱉蟲具有多成分-多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。54個成分對應(yīng)653個靶點(diǎn)，而GeneCard數(shù)據(jù)庫僅識別出613個靶點(diǎn)信息，最終得出54個成分對應(yīng)與破血逐瘀功效相關(guān)的靶點(diǎn)為26個。但主要活性成分與重要靶蛋白之間無較好的結(jié)合性，靶蛋白之間相互作用構(gòu)成了較為簡單的網(wǎng)絡(luò)，說明這些靶蛋白之間無很強(qiáng)的相互作用關(guān)系，不能很好地揭示土鱉蟲破血逐瘀的機(jī)制。

土鱉蟲入血的54種成分主要為有機(jī)酸類、核苷類和游離氨基酸類物質(zhì)，結(jié)合實驗結(jié)果可知，小分子直接跨膜進(jìn)入細(xì)胞，影響相關(guān)受體進(jìn)而影響相關(guān)通路，發(fā)揮相應(yīng)的生物活性，達(dá)到治療疾病的目的。但土鱉蟲中主要成分為蛋白質(zhì)，而大分子蛋白質(zhì)無法直接跨膜，需經(jīng)胃腸道消化后方可進(jìn)入人體發(fā)揮藥效作用[15-17]，因此網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實驗中根據(jù)OB和DL等參數(shù)作為篩選成分的依據(jù)時會直接將土鱉蟲蛋白質(zhì)完全剔除。而體外纖溶實驗結(jié)果表明，土鱉蟲水溶性蛋白質(zhì)較其他成分具有更強(qiáng)的降解纖維蛋白能力。綜上所述，動物藥采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等分子靶點(diǎn)預(yù)測功能具有一定片面性。因此實驗后期會針對土鱉蟲各物質(zhì)，特別注重蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)開展活血化瘀相關(guān)實驗研究，探究土鱉蟲作用于心血管疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。