甘雨，吳端，張棟，王星文，馬婷玉，向麗*，王輝

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所 中藥鑒定與安全性評(píng)估北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2.北京城市學(xué)院，北京 100083；3.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025

黃花蒿ArtemisiaannuaL.又名臭蒿，為菊科蒿屬1年生草本藥用植物，有清熱解暑、截瘧、涼血之效，富含揮發(fā)油、青蒿素、青蒿酸、黃酮類等次生代謝物質(zhì)，是一線抗瘧藥物青蒿素的唯一天然來源[1]。目前，以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(ACTs)是世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的最有效的治療瘧疾的方法，療效好、起效快且不良反應(yīng)較小。研究發(fā)現(xiàn)，黃花蒿廣布于歐洲和亞洲的溫帶、寒溫帶及亞熱帶地區(qū)，世界大部分地區(qū)黃花蒿中青蒿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)<0.2%，而我國黃花蒿資源中青蒿素含量由南到北逐漸降低[2]。隨著青蒿素及其衍生物新適應(yīng)證范圍的不斷擴(kuò)大，黃花蒿的市場需求顯著增加，有效提高青蒿素的含量成為黃花蒿優(yōu)良品種選育的重點(diǎn)研究方向。

青蒿素是一種具有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，其生物合成通過植物類異戊二烯代謝途徑中的甲羥戊酸途徑進(jìn)行，受羥甲基戊二酸輔酶A還原酶(HMGR)、紫穗槐二烯合酶(ADS)、紫穗槐二烯氧化酶(CYP71AV1)等多種酶調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控青蒿素生物合成特異途徑的基因表達(dá)可以有效促進(jìn)青蒿素積累，如調(diào)控HMGR、ADS基因的表達(dá)，提高前體物質(zhì)青蒿酸及青蒿素含量[3-5]；過表達(dá)FPS、CYP71AV1、CPR基因，提高轉(zhuǎn)基因黃花蒿植物中青蒿素含量[6-7]。因此，探究青蒿素合成關(guān)鍵基因及其調(diào)控機(jī)制對(duì)于促進(jìn)青蒿素合成和積累具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中一類重要的調(diào)節(jié)因子，通過與順式元件相互作用，調(diào)控特定基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)藥用植物次生代謝物質(zhì)的合成和積累。AaWRKY1是黃花蒿中第一個(gè)成功克隆和驗(yàn)證的轉(zhuǎn)錄因子，其通過結(jié)合ADS和CYP71AV1基因啟動(dòng)子的W-box，激活青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，促進(jìn)青蒿素積累；此外，轉(zhuǎn)錄因子AaMYC2通過激活CYP71AV1和DBR2基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)青蒿素含量增加[4，8]。bHLH(basic-helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣泛、最保守的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其保守結(jié)構(gòu)域由約60個(gè)氨基酸組成，包含Basic和HLH 2個(gè)不同的功能區(qū)域[9-10]。Ji等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃花蒿bHLH1(AabHLH1)轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性結(jié)合青蒿素生物合成的關(guān)鍵基因ADS和CYP71AV1基因啟動(dòng)子上的E-box順式作用元件，正向調(diào)控青蒿素的合成和積累；黃花蒿葉中瞬時(shí)共轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)AabHLH1基因活性顯著表達(dá)，但E-box突變會(huì)導(dǎo)致該基因激活取消[11]。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)的不斷發(fā)展，全基因組水平的生物信息學(xué)分析成為藥用植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究熱點(diǎn)，目前，丹參[12]、人參[13]、西洋參[14]、黑果枸杞[15]等藥用植物中均報(bào)道了全基因組水平bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究，而黃花蒿中尚未見詳細(xì)報(bào)道。因此，全基因組水平AabHLH轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及相關(guān)生物信息學(xué)分析，對(duì)于進(jìn)一步探究bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能及其在青蒿素生物合成中的作用具有重要意義。

光照是調(diào)控藥用植物生長發(fā)育的重要因子，參與植物生命周期的眾多生物學(xué)過程，不同波長的光(即光質(zhì))對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累具有不同的效果。付金穎等[16]發(fā)現(xiàn)環(huán)境紫外(UV)-B輻射能顯著提高杜仲葉片中黃酮、總酚和鞣質(zhì)等次生代謝物質(zhì)含量。閻秀峰等[17]發(fā)現(xiàn)紅光可增強(qiáng)高山紅景天根中的紅景天苷積累。趙德修等[18]發(fā)現(xiàn)藍(lán)光能顯著提高水母雪蓮中黃酮類物質(zhì)的合成，而紅光強(qiáng)烈抑制黃酮類物質(zhì)的合成。因而探究不同光質(zhì)對(duì)次生代謝物質(zhì)生物合成及調(diào)控機(jī)制，對(duì)于提高藥材品質(zhì)及選育優(yōu)良品種具有重要意義。光照在青蒿素生物合成途徑中具有重要作用，Rai等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與非UV照射相比，UV-B和UV-C處理后，青蒿的生物量及生長發(fā)育階段次生代謝物質(zhì)(青蒿素和類黃酮)含量增加。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，紅光和藍(lán)光可以通過促進(jìn)青蒿素生物合成途徑中的基因如ADS、CYP71AV1的表達(dá)而增強(qiáng)青蒿素的積累。Lopes等[21]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光和黃光會(huì)影響黃花蒿新陳代謝和形態(tài)，而藍(lán)光和紅光促進(jìn)脫氧木酮糖-5-磷酸/2-甲基赤蘚醇磷酸(DOXP/MEP)途徑而促進(jìn)青蒿素積累。本研究利用黃花蒿基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過對(duì)AabHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行鑒定及相關(guān)生物學(xué)分析，對(duì)不同光質(zhì)處理下AabHLH基因表達(dá)模式進(jìn)行探究，為進(jìn)一步研究bHLH基因結(jié)構(gòu)及其在青蒿素合成中的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 AabHLH基因鑒定及理化性質(zhì)分析

以黃花蒿全基因組數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào)：PRJNA416223)為研究對(duì)象，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)、編碼序列數(shù)據(jù)及全基因組數(shù)據(jù)下載于國際核酸序列數(shù)據(jù)庫DDBJ/EMBL/GenBank(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)。通過Pfam數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)在線搜索獲取bHLH轉(zhuǎn)錄因子隱馬爾可夫模型(HMM)文件(ID：PF00010)，利用本地Hmmsearch程序?qū)S花蒿蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行全基因組比對(duì)搜索，初步獲取AabHLH候選基因。Pfam數(shù)據(jù)庫(http：//Pfam.sanger.ac.uk/search)進(jìn)一步對(duì)候選基因進(jìn)行鑒定，篩選具有bHLH蛋白保守結(jié)構(gòu)域的AabHLH轉(zhuǎn)錄因子成員。并利用在線工具ExPASy(http：//www.expasy.org/)對(duì)AabHLH蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、總平均親水性等蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測[22]。使用在線軟件Cell-PLoc 2.0(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對(duì)AabHLH蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測及分析。

1.2 AabHLH基因多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用ClustalX軟件對(duì)AabHLH蛋白的保守域進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，分析參數(shù)使用鄰接法(neighbor-joining，NJ)的Poisson model 模型構(gòu)建，并進(jìn)行1000次Bootstrap抽樣；利用iTOL在線軟件(https：//itol.embl.de/)對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行可視化修飾分析[23]。

1.3 基因進(jìn)化壓力分析

非同義替換率/同義替換率(Ka/Ks)通常用于判斷是否有選擇壓力作用于蛋白質(zhì)編碼基因。通過ClustalX軟件對(duì)AabHLH復(fù)制基因?qū)Φ木幋a區(qū)核酸序列進(jìn)行兩兩比對(duì)，利用TBtools軟件Simple KaKs/Calculato工具計(jì)算AabHLH核苷酸的Ks和Ka，基于Ka/Ks值評(píng)估每個(gè)基因?qū)Φ倪M(jìn)化壓力。

1.4 基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

通過解析黃花蒿基因組數(shù)據(jù)，獲取AabHLH基因?qū)?yīng)的蛋白序列和編碼序列(CDS)，利用在線工具GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)AabHLH基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測及可視化分析；利用在線工具M(jìn)EME(http：//meme-suite.org/tools/meme)預(yù)測AabHLH蛋白保守基序并進(jìn)行相關(guān)分析。

1.5 光調(diào)控下基因表達(dá)分析

黃花蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載于美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào)：SRP133983)，通過解析不同光照調(diào)控下黃花蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲取藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光、白光、黑暗處理下AabHLH轉(zhuǎn)錄因子FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值，利用TBtools在線工具(https：//www.biorxiv.org/)對(duì)其進(jìn)行聚類及可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AabHLH基因鑒定及理化性質(zhì)分析

根據(jù)HMM檢索結(jié)果，將初步獲得的黃花蒿bHLH蛋白序列提交至Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證，去除不含或較不完整的bHLH典型結(jié)構(gòu)域(PF00010)的序列，結(jié)果如表1所示，最終從黃花蒿全基因組中鑒定出99個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員用于后續(xù)分析。與全基因組水平已鑒定的藥用植物bHLH基因數(shù)量相比，AabHLH基因數(shù)量少于人參(169個(gè))、丹參(127個(gè))、黑枸杞(132個(gè))，但多于西洋參(62個(gè))[12-15]。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，AabHLH蛋白平均含有368個(gè)氨基酸殘基，最短的AabHLH蛋白含有153個(gè)氨基酸(PWA77406.1)，最長的AabHLH蛋白含有1002個(gè)氨基酸(PWA85745.1)，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為17 450、114 070；理論等電點(diǎn)為4.64(PWA88561.1)～10.08(PWA42437.1)。其中，57個(gè)蛋白等電點(diǎn)>7.5，顯堿性，26個(gè)蛋白等電點(diǎn)<6.5，顯酸性；亞細(xì)胞定位及親水性分析發(fā)現(xiàn)，所有AabHLH蛋白均定位于細(xì)胞核且均為親水性蛋白。

表1 AabHLH家族信息

2.2 AabHLH基因進(jìn)化分析

為了研究AabHLH系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的相似性，利用MAGA 7.0軟件對(duì)篩選出的99條AabHLH蛋白序列構(gòu)建無根系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖1?；诿總€(gè)分支的統(tǒng)計(jì)支撐，根據(jù)Bootstrap>80，將AabHLH家族成員分為13個(gè)亞族，其中Ⅳ亞族包含最多的AabHLH蛋白(19個(gè))，其次是Ⅲ(16個(gè))、Ⅻ(15個(gè))、Ⅺ(12個(gè))3個(gè)亞族，最少的是ⅩⅢ亞族，只含有1個(gè)AabHLH蛋白(PWA55744.1)，其余亞族中AabHLH蛋白成員數(shù)在2～8個(gè)。

圖1 AabHLH家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 AabHLH基因進(jìn)化壓力分析

遺傳學(xué)中通常用Ka/Ks表示基因復(fù)制后所經(jīng)歷的環(huán)境選擇壓力，通常情況下，Ka/Ks>1表示正選擇效應(yīng)，Ka/Ks=1表示中性選擇，而Ka/Ks<1表示陰性或純化選擇。99條AabHLH基因中共含有49對(duì)復(fù)制基因?qū)?表2)。對(duì)AabHLH基因中49對(duì)復(fù)制基因的環(huán)境選擇壓力進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，除了PWA60184.1/PWA60186.1和PWA63778.1/PWA63780.1基因?qū)ξ茨苡行в?jì)算Ka/Ks值，PWA52642.1/PWA52643.1和PWA89112.1/PWA89113.1基因?qū)a/Ks值>1外，其余45個(gè)復(fù)制基因?qū)a/Ks均小于1，表明AabHLH基因間在進(jìn)化時(shí)存在純化選擇作用[24]。

表2 AabHLH基因Ka/Ks分析

2.4 AabHLH基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

為了進(jìn)一步探究AabHLH基因之間的結(jié)構(gòu)與進(jìn)化關(guān)系，繪制AabHLH基因結(jié)構(gòu)圖(圖2A)。結(jié)果顯示，99條AabHLH基因外顯子數(shù)目為1～18個(gè)不等，其中有7條AabHLH基因不含內(nèi)含子結(jié)構(gòu)；除個(gè)別AabHLH基因外，同一個(gè)亞家族中的基因成員具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，造成不同亞族基因結(jié)構(gòu)差異的原因可能是AabHLH基因家族在進(jìn)化過程中內(nèi)含子插入或者缺失導(dǎo)致[25]。

為了探究AabHLH蛋白結(jié)構(gòu)多樣性，通過MEME預(yù)測了99個(gè)AabHLH蛋白保守基序(圖2B)。結(jié)果顯示，AabHLH蛋白含有3個(gè)保守motif(motif1、motif2、motif3)，且同一亞族基本含有相同基序；其中，motif1和motif2含有AabHLH蛋白保守結(jié)構(gòu)域的特征基序(HX3ERXRRX9LX4PX3KXDX14L)，兩者的差異主要是motif1第1個(gè)位置的氨基酸為K/N/D/V，第2～50氨基酸為AabHLH保守基序，而motif2的1～49氨基酸位置為AabHLH保守基序，第50個(gè)氨基酸為K/Q/E。對(duì)保守基序進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，與其他植物相似，AabHLH蛋白基序包含N端堿性區(qū)域和C端2個(gè)HLHα-螺旋區(qū)，堿性區(qū)域具有DNA結(jié)合位點(diǎn)Glu或Arg且相對(duì)保守。值得注意的是，大多數(shù)保守基序位于bHLH結(jié)構(gòu)域的C末端，且除了PWA72494.1基因外，其余AabHLH基因均只含有1個(gè)保守的bHLH結(jié)構(gòu)域。

注：A.系統(tǒng)進(jìn)化樹；B.motif分布圖；C.基因結(jié)構(gòu)圖。

圖3 黃花蒿bHLH蛋白保守基序

2.5 AabHLH基因表達(dá)分析

光作為調(diào)控植物生長發(fā)育最重要的環(huán)境因子之一，在黃花蒿青蒿素合成中代謝途徑調(diào)控中具有重要作用。對(duì)藍(lán)光、黑暗、紅光、遠(yuǎn)紅光、白光處理下AabHLH基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。除了PWA51892.1、PWA63778.1、PWA42909.1、PWA52643.1、PWA41055.1、PWA89112.1、PWA89113.1、PWA67205.1基因外，其余91條AabHLH基因均注釋到基因表達(dá)數(shù)據(jù)。其中，約12%基因不響應(yīng)光脅迫；與黑暗處理相比，約23%、42%、46%、37%基因分別在遠(yuǎn)紅光、白光、紅光、藍(lán)光處理下基因表達(dá)量提高。

注：不同的顏色代表不同表達(dá)量，數(shù)值越大，表達(dá)量越高。

AabHLH基因表達(dá)圖譜分析發(fā)現(xiàn)，與黑暗處理相比，13個(gè)亞族中，Ⅺ、Ⅰ、Ⅴ、Ⅱ、Ⅳ亞族基因整體水平上在不同光處理下不表達(dá)或表達(dá)量較低，而Ⅶ、ⅩⅢ亞族基因在光處理下基因表達(dá)降低；Ⅲ、Ⅹ、Ⅸ、Ⅶ亞族基因在光調(diào)控下基因表達(dá)量均有所提高，尤其在白光調(diào)控下其基因表達(dá)量明顯提高。此外，Ⅻ、Ⅵ亞族基因在紅光和藍(lán)光處理下，其基因表達(dá)量顯著提高，推測其可能與青蒿素合成下游途徑中關(guān)鍵酶基因ADS、CYP71AV1表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其基因功能的探究對(duì)于青蒿素合成及調(diào)控機(jī)制等研究具有重要意義。

3 討論

黃花蒿是中藥青蒿的基原植物，始載于《五十二病方》，在《神農(nóng)本草經(jīng)》《大觀本草》《重修政和經(jīng)史證類備用本草》《本草綱目》等歷代本草中均有記載，有2000多年的應(yīng)用歷史?！吨袊幍洹?020年版記載青蒿味苦、辛，性寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清虛熱、除骨蒸、解暑熱、截瘧、退黃等功效，用于溫邪傷陰、夜熱早涼、陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、暑邪發(fā)熱、瘧疾、寒熱、濕熱黃疸[26]。作為抗瘧一線藥物青蒿素的唯一天然植物來源，黃花蒿中青蒿素含量普遍較低。根據(jù)本草基因組學(xué)研究指導(dǎo)建立含有重要活性成分的青蒿基因組研究體系，通過對(duì)青蒿素等重要次生代謝物質(zhì)的合成途徑關(guān)鍵基因的挖掘及其調(diào)控機(jī)制的研究，能夠?yàn)榍噍锲贩N改良、基因資源保護(hù)及藥性研究提供參考[27-28]。

轉(zhuǎn)錄因子是影響中藥藥效的重要調(diào)控因子，其通過調(diào)控藥用植物次生代謝物質(zhì)合成酶基因的表達(dá)，激活中藥有效成分的合成和定向積累。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族作為植物中第二大類轉(zhuǎn)錄因子，其通過在轉(zhuǎn)錄水平與相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件結(jié)合，激活或抑制基因的表達(dá)，參與調(diào)控植物生長發(fā)育、植物生物合成及脅迫響應(yīng)等過程[29-31]。萜類物質(zhì)作為藥用植物重要活性物質(zhì)，其合成和調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)于中藥的開發(fā)應(yīng)用及藥性研究具有重要意義。目前，許多研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子能有效調(diào)控藥用植物萜類物質(zhì)的合成和積累，如擬南芥中MYC基因通過與DELLA蛋白互作調(diào)控倍半萜(E)-β-石竹烯合成，PIF5轉(zhuǎn)錄因子以同源聚體的形式促進(jìn)四萜類化合物類胡蘿素的積累[32-33]；長春花中BIS1、BIS2轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控生物堿早期合成基因轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)單萜吲哚生物堿(MIA)的合成[34]；蒺藜狀苜蓿中TSAR1和TSAR2通過結(jié)合并激活HMGR1和MAKIBISHI1基因表達(dá),促進(jìn)三萜皂苷生物合成[35]；青蒿AabHLH1轉(zhuǎn)錄因子通過激活A(yù)DS和CYP71AV1基因表達(dá),正向調(diào)控青蒿素生物合成和積累[11]。此外，bHLH轉(zhuǎn)錄因子還參與植物類黃酮、生物堿等次生代謝物合成調(diào)控[36]，如葡萄MYC1基因與MYB轉(zhuǎn)錄因子作用時(shí)激活類黃酮合成途徑中GHI、UFGT、ANR基因表達(dá)，而單獨(dú)作用時(shí)基因不表達(dá)[37-38]；Yamada等[39]報(bào)道在黃連中bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控異喹啉類生物堿(IQAs)啟動(dòng)子表達(dá)。

為了進(jìn)一步了解bHLH轉(zhuǎn)錄因子在黃花蒿倍半萜物質(zhì)青蒿素生物合成中的調(diào)控作用，本研究基于黃花蒿全基因組水平對(duì)AabHLH基因進(jìn)行鑒定及光調(diào)控下基因表達(dá)模式分析。結(jié)果共鑒定出99條AabHLH基因，共包含49對(duì)復(fù)制基因?qū)?，其?5對(duì)基因間在進(jìn)化時(shí)存在純化選擇；對(duì)蛋白理化性質(zhì)分析表明，AabHLH蛋白均定位于細(xì)胞核且均為親水性蛋白，但蛋白質(zhì)大小、相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)等在不同AabHLH蛋白間存在差異，推測差異原因可能與基因功能有關(guān)。基于系統(tǒng)進(jìn)化樹每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)支撐(Bootstrap>80)，將AabHLH基因分為13個(gè)亞族，每個(gè)亞族成員在1～19個(gè)不等，同一個(gè)亞族中的基因成員較其他亞族成員具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及保守基序結(jié)構(gòu)，具有較高的保守性；但不同亞族間基因結(jié)構(gòu)具有較大差異，造成差異的原因可能是基因在進(jìn)化過程中內(nèi)含子的插入和缺失。而后通過對(duì)黃花蒿bHLH保守結(jié)構(gòu)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)AabHLH蛋白含有3個(gè)保守motifs且多數(shù)motifs位于bHLH結(jié)構(gòu)域的C末端，其中motif1、motif2均為黃花蒿bHLH保守基序，約由50氨基酸組成；除PWA72494.1基因外，其余AabHLH基因均有且只有1個(gè)保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，因此，該基因結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能具有進(jìn)一步研究意義。

研究發(fā)現(xiàn)，光顯著提高青蒿素合成上游途徑中關(guān)鍵酶基因如HMGS、DXS、DHR等表達(dá)，正向調(diào)控青蒿素積累，且白光比單色光更能促進(jìn)青蒿素前體物質(zhì)的積累[21]；在青蒿素合成下游途徑中，紅光、白光、藍(lán)光顯著提高ADS、CYP71AV1基因表達(dá)，藍(lán)光通過促進(jìn)ALDH1和DBR2基因表達(dá)和抑制ESC和SQS基因表達(dá)，促進(jìn)青蒿素積累[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與黑暗處理相比，13個(gè)亞族中Ⅺ、Ⅰ、Ⅴ、Ⅱ、Ⅳ亞族基因整體水平上在不同光處理下基因不表達(dá)或表達(dá)量較低，而Ⅶ、ⅩⅢ亞族基因在光處理下基因表達(dá)降低，推測這些亞族基因非光調(diào)控下黃花蒿青蒿素合成關(guān)鍵調(diào)控基因，其基因功能有待在其他研究中進(jìn)一步發(fā)掘。參考Zhang等[20]報(bào)道的青蒿素生物合成關(guān)鍵基因表達(dá)特征，本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ、Ⅹ、Ⅸ、Ⅶ亞族基因在光調(diào)控下基因表達(dá)模式與HMGS、DXS、DHR等基因表達(dá)相似，推測這4個(gè)亞族基因功能可能與HMGS、DXS、DHR等基因調(diào)控有關(guān)，具體的基因功能有待進(jìn)一步生物學(xué)驗(yàn)證；而紅光和藍(lán)光處理下，Ⅻ、Ⅵ亞族基因表達(dá)量顯著提高，推測其可能與青蒿素合成下游途徑中關(guān)鍵基因ADS、CYP71AV1表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其基因功能的探究對(duì)于青蒿素合成及調(diào)控機(jī)制的研究具有重要意義。