米文強(qiáng)，任風(fēng)芝，劉建芬，張向彬，王彩肖

(1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015；2.華北制藥華坤河北生物技術(shù)有限公司，河北 石家莊 050000)

圖1 那屈肝素鈣的結(jié)構(gòu)式

圖2 N-NO加合物的結(jié)構(gòu)式

歐洲藥典(EP)提供了一個(gè)將N-NO基團(tuán)轉(zhuǎn)化為NO的化學(xué)過(guò)程，該方法使用氫溴酸在乙酸乙酯回流環(huán)境中使供試品脫去N-NO基團(tuán)，產(chǎn)生的NO由氬氣作為載氣送入熱能分析儀進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而計(jì)算供試品中N-NO基團(tuán)的含量[1]。為保證檢測(cè)方法有較高的靈敏度和較好的穩(wěn)定性，該方法使用了-120 ℃及-160 ℃冷阱。EP規(guī)定那屈肝素鈣中的N-NO基團(tuán)限度為0.25 μg·mL-1。

參照EP方法，作者利用市售設(shè)備，采用乙酸乙酯回流液中的氫溴酸(用冰醋酸稀釋至30%)將N-NO基團(tuán)從反應(yīng)物主鏈斷下[5-7]生成NO；經(jīng)氮?dú)廨d運(yùn)至檢測(cè)器，與臭氧發(fā)生反應(yīng)，生成具有熒光效應(yīng)的NO2，進(jìn)而被記錄信號(hào)生成色譜圖，進(jìn)行那屈肝素鈣中N-NO基團(tuán)含量的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)裝置如圖3所示。

圖3 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

那屈肝素鈣，自制；N-亞硝基二丙胺(NDPA)對(duì)照品，Sigma；無(wú)水乙醇(色譜純)；氨基磺酸(分析純)；甲酰胺(優(yōu)級(jí)純)；氫溴酸(分析純)；冰醋酸(分析純)；乙酸乙酯(優(yōu)級(jí)純)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，自制。

冷卻循環(huán)泵；真空泵；臭氧發(fā)生器；800系列熱能分析儀，英國(guó)Ellutia；超純水機(jī)，美國(guó)Pall。

1.2 溶液的配制

反應(yīng)液：稱取氨基磺酸20 g置于燒杯中，加乙酸乙酯100 mL，攪拌至懸濁狀態(tài)，放置3 d，經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾，得到乙酸乙酯反應(yīng)液；用冰醋酸將40%氫溴酸稀釋至30%；取15 mL乙酸乙酯反應(yīng)液與5 mL 30%氫溴酸混合，即得。

甲酰胺溶液：稱取氨基磺酸10 g，溶解于190 mL甲酰胺和10 mL超純水混合液中，即得。

NDPA對(duì)照溶液：取NDPA對(duì)照品1支(100 mg)，置于100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度；精密量取上述溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，得到NDPA對(duì)照貯備溶液；分別精密量取NDPA對(duì)照貯備溶液30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL、180 μL置于10 mL容量瓶中，用甲酰胺溶液定容至刻度，得到不同濃度的NDPA對(duì)照溶液。

供試溶液：精密稱取那屈肝素鈣0.1 g，用1 mL甲酰胺溶液溶解，即得。

土地利用總體規(guī)劃所確定的城市村鎮(zhèn)建設(shè)用地，被稱為“圈內(nèi)用地”。為實(shí)施規(guī)劃，需要占用圈內(nèi)用地，涉及農(nóng)用地的，應(yīng)當(dāng)辦理農(nóng)用地轉(zhuǎn)用審批手續(xù)；涉及集體所有土地的，應(yīng)當(dāng)辦理土地征收審批手續(xù)。在已批準(zhǔn)的農(nóng)用地轉(zhuǎn)用范圍內(nèi)，具體建設(shè)項(xiàng)目用地由市、縣人民政府批準(zhǔn)，由市、縣國(guó)土資源部門(mén)依法供應(yīng)。

1.3 N-NO基團(tuán)含量的測(cè)定

平衡系統(tǒng)，將超純水、甲酰胺溶液、NDPA對(duì)照溶液、供試溶液依次進(jìn)樣，記錄色譜圖；繪制NDPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由回歸方程按下式計(jì)算供試溶液中N-NO基團(tuán)含量(μg·mL-1)：

式中：c1為供試溶液中NDPA濃度，ng·mL-1；c為供試溶液濃度，g·mL-1；44為N-NO基團(tuán)的分子量；130為NDPA的分子量；1 000為換算系數(shù)。

1.4 分析條件

氮?dú)鈮毫? psi；氧氣壓力2 psi；靈敏度235；冷卻液溫度≤-20 ℃；液滴回流速度1～2滴·s-1；進(jìn)樣量50 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性

將無(wú)水乙醇、冰醋酸、超純水、甲酰胺溶液、供試溶液、60 ng·mL-1NDPA對(duì)照溶液依次進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 專屬性實(shí)驗(yàn)

從圖4可以看出，無(wú)水乙醇、冰醋酸、超純水、甲酰胺溶液均不產(chǎn)生干擾峰，供試溶液主峰與NDPA對(duì)照溶液主峰一致，無(wú)顯著差異。

2.1.2 線性范圍

取30～180 μg·mL-1NDPA對(duì)照溶液依次進(jìn)樣，以NDPA對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，擬合得回歸方程：y=39.36+6.95x，R2=0.9991。表明NDPA濃度在30～180 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖5 NDPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 靈敏度

取NDPA對(duì)照溶液進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果表明，當(dāng)NDPA對(duì)照溶液濃度低至30 ng·mL-1(相當(dāng)于供試品中N-NO基團(tuán)含量約為0.17 μg·mL-1)時(shí)，S/N≈3，即檢出限為30 ng·mL-1；當(dāng)NDPA對(duì)照溶液濃度低至50 ng·mL-1(相當(dāng)于供試品中的N-NO基團(tuán)含量約為0.10 μg·mL-1)時(shí)，S/N≈10，即定量限為50 ng·mL-1。

2.1.4 精密度

配制74 ng·mL-1NDPA對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積分別為522.364、521.172、519.345、520.788、508.816、519.364，RSD=0.87%；取供試溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積分別為379.157、381.164、388.827、385.520、392.386、393.448，RSD=1.38%。

平行配制6份供試溶液，平衡系統(tǒng)，按1.4條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得N-NO基團(tuán)含量(μg·mL-1)分別為0.17、0.17、0.19、0.18、0.18、0.18，RSD=3.8%；變更實(shí)驗(yàn)員、檢驗(yàn)日期，按重復(fù)性方法實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行精密度驗(yàn)證，測(cè)得N-NO基團(tuán)含量(μg·mL-1)分別為0.18、0.18、0.17、0.17、0.18、0.18，RSD=3.3%。

2.1.5 加標(biāo)回收率

精密稱取那屈肝素鈣約1 g，加入約相當(dāng)于供試品中N-NO基團(tuán)含量80%的NDPA對(duì)照品，用甲酰胺溶液定容至10 mL。同法配制100%、120%加樣供試溶液，各平行3份，測(cè)定各溶液中N-NO含量，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加標(biāo)回收率

2.2 實(shí)際樣品測(cè)定

自制3批那屈肝素鈣，按1.2方法制備供試溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得N-NO含量(μg·mL-1)分別為0.17、0.18、0.18，均低于EP規(guī)定的限度0.25 μg·mL-1。

3 結(jié)論

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，確定的熱能分析儀法檢測(cè)那屈肝素鈣中N-NO基團(tuán)含量的方法具有專屬性好、靈敏度高、精密度好、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，且采用的儀器裝置相比EP方法更為簡(jiǎn)單易控，適用于那屈肝素鈣中N-NO基團(tuán)含量的測(cè)定。受制于市售設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)裝置未能采用更低溫的冷阱以進(jìn)一步提高靈敏度[5]。