蔡海林，謝鵬飛，曾維愛，趙阿娟，翟爭(zhēng)光，劉 佳，朱 航，周 勇*

（1.湖南省煙草公司長(zhǎng)沙市公司，長(zhǎng)沙410011；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，長(zhǎng)沙410125）

甲基嘧啶磷作為一種廣譜性有機(jī)磷殺蟲殺螨劑，其速效性好，滲透力強(qiáng)，對(duì)蔬菜、糧谷害蟲及衛(wèi)生害蟲等有良好的防治效果，還具有觸殺、胃毒和一定的熏蒸作用[1-3]。有研究表明，甲基嘧啶磷對(duì)哺乳類動(dòng)物的急性毒性比敵敵畏低很多[4]，若在其有效劑量下對(duì)煙葉香味沒有影響，就可以應(yīng)用于烤煙倉(cāng)庫(kù)害蟲的防治[5]。甲基嘧啶磷在國(guó)外應(yīng)用于烤煙倉(cāng)庫(kù)中防治倉(cāng)儲(chǔ)害蟲[6]，雖然其在國(guó)內(nèi)沒有在烤煙作物上進(jìn)行登記，但實(shí)際上在烤煙倉(cāng)儲(chǔ)過程中也有將其用于防治害蟲的情況。甲基嘧啶磷殘留量過多會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生不良影響，其分解產(chǎn)物也可能會(huì)對(duì)人的身體健康產(chǎn)生嚴(yán)重的危害[7-8]。

煙草作為特殊的經(jīng)濟(jì)作物，其安全性在國(guó)際貿(mào)易中受到各個(gè)國(guó)家的特別關(guān)注，其農(nóng)藥殘留問題也一直是煙草行業(yè)乃至社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)[9-10]。因此，快速準(zhǔn)確地測(cè)定煙草中甲基嘧啶磷的農(nóng)藥殘留量是必要的。目前食品中甲基嘧啶磷殘留測(cè)定分析方法有氣相色譜法[11-13]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-17]等，未見烤煙中甲基嘧啶磷的殘留情況及檢測(cè)方法的報(bào)道。筆者建立了用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定烤煙中甲基嘧啶磷殘留量的方法，該方法簡(jiǎn)便高效，靈敏度高，適合烤煙中甲基嘧啶磷殘留量的檢測(cè)，為烤煙中甲基嘧啶磷的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TSQ Endura三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾公司；Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm×1.9 μm）色譜柱；ME104E電子天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司；YP5102電子天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；MTV-100多管旋渦混合儀，杭州奧盛儀器有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠；TDZ5-WS低速離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司；DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱，中儀國(guó)科科技有限公司；TGL-16A高速冷凍離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司；Blixer 6 V.V乳化攪拌機(jī)，法國(guó)羅伯特有限公司。

乙腈（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純），德國(guó)默克公司；甲酸（色譜純）、C18、GCB、PSA，德國(guó)CNW科技公司；氯化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水，屈臣氏集團(tuán)有限公司。

甲基嘧啶磷標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)樣品前處理

稱取粉碎后的烤煙樣品5.0 g置于100 mL離心管中，加入10 mL超純水，再加30 mL乙腈溶液，渦旋5 min，隨后加5.0 g氯化鈉，繼續(xù)渦旋3 min后取出，于4 000 r/min條件下離心3 min，移取上清液1.5 mL于裝有10 mg GCB和40 mg C18凈化劑的2 mL離心管中，渦旋1 min后于10 000 r/min條件下離心3 min，取1 mL上清液過0.22μm有機(jī)濾膜，裝入進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.3 色譜和質(zhì)譜檢測(cè)條件

液相色譜條件：流速為0.3 mL/min；流動(dòng)相B為甲醇，流動(dòng)相C為0.1%甲酸水溶液；柱箱溫度為35℃；進(jìn)樣量為5μL。梯度洗脫程序：0～0.5 min 20% B；0.5～2.0 min 20%～95% B；2.0～4.5 min 95% B；4.5～4.6 min 95%～20%B；4.6～5.5 min 20%B。

質(zhì)譜條件：電離源模式為ESI；電離源極性為正；霧化氣為氮?dú)?；鞘氣壓力?76 kPa；離子傳輸管溫度為310℃；噴針溫度為330℃；離子噴霧電壓為3 500 V。

甲基嘧啶磷的保留時(shí)間、母離子、子離子和碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 甲基嘧啶磷質(zhì)譜參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.010 1 g甲基嘧啶磷標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈進(jìn)行溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的母液，用甲醇進(jìn)行稀釋成濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，再用甲醇進(jìn)行稀釋并配制成濃度分別為1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 添加回收率試驗(yàn)

稱取烤煙空白樣品5.0 g置于100 mL離心管中，添加濃度分別為0.03、0.3、3 mg/kg，添加后進(jìn)行振蕩充分混勻，靜置30 min，將靜置后的樣品按照1.2的提取與凈化步驟和1.3的儀器條件進(jìn)行分析檢測(cè)，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-MS/MS條件的選擇

分別測(cè)試甲基嘧啶磷在ESI源正離子、ESI源負(fù)離子掃描方式下的信號(hào)強(qiáng)度，其中ESI源正離子響應(yīng)相對(duì)較好。通過對(duì)碎裂電壓和碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選擇306.000/164.111作為定量離子對(duì)，306.000/278.000作為定性離子對(duì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。甲基嘧啶磷色譜圖見圖1。

圖1 甲基嘧啶磷色譜圖

選擇甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，采用相同梯度洗脫條件進(jìn)行甲基嘧啶磷檢測(cè)。結(jié)果表明，甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，甲基嘧啶磷響應(yīng)較高并且峰形更好。

2.2 提取條件的選擇

前處理過程中選用乙腈作為提取劑，因乙腈通用性強(qiáng)，且乙腈較難提取糖、蛋白質(zhì)類化合物，這樣提取液中的干擾基質(zhì)很少。為了提高提取效果，加入適當(dāng)純水有助于增強(qiáng)乙腈對(duì)烤煙基質(zhì)的滲透性。

2.3 凈化劑的選擇

烤煙樣品基質(zhì)中含有色素及油脂等雜質(zhì)[18]，基質(zhì)較為復(fù)雜，因此凈化劑的選擇對(duì)后續(xù)的樣品檢測(cè)及整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果尤為重要。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了GCB＋PSA和GCB＋C182種凈化劑組合的凈化效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GCB＋PSA凈化劑進(jìn)行處理后得到的樣品添加回收率相對(duì)較低，GCB＋C18的凈化后得到的樣品添加回收率相對(duì)較好，起到較好的凈化效果，達(dá)到要求。

2.4 方法的線性

分別將配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005 mg/L）按照濃度從低到高的順序進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3次。以其溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明在0.005～1 mg/L范圍內(nèi)，甲基嘧啶磷線性關(guān)系良好，得到甲基嘧啶磷的線性回歸方程為y=38 991 544x＋497 969，相關(guān)系數(shù)R2為0.996 4。

2.5 添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在烤煙基質(zhì)中進(jìn)行3個(gè)水平的添加回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)5次。甲基嘧啶磷在烤煙中的添加回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，甲基嘧啶磷在烤煙中的平均回收率為86.9%～92.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～11.5%，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求?？緹熖砑訕悠飞V圖見圖2。

表2 甲基嘧啶磷在烤煙中的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖2 烤煙添加樣品色譜圖

2.6 方法定量限

方法的定量限為添加回收試驗(yàn)的最低添加濃度，甲基嘧啶磷在烤煙中的定量限為0.03 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究建立了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定烤煙中甲基嘧啶磷殘留量的分析方法?？緹煒悠方?jīng)乙腈提取，GCB和C18凈化，HPLC-MS/MS測(cè)定。甲基嘧啶磷在烤煙中的平均回收率為86.9%～92.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～11.5%。本方法操作簡(jiǎn)單方便、高效準(zhǔn)確，適用于烤煙中甲基嘧啶磷的殘留檢測(cè)。