戰(zhàn)櫟，王偉東，晏磊

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

淡水湖泊中蘊(yùn)含著大量的微生物資源，微生物在淡水湖泊中主要受氣候變化的影響、生物地球化學(xué)循環(huán)的調(diào)控，微生物對于維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定起著非常重要的作用[1]。相比于海洋微生物，微生物在淡水沉積物中通常對光照、pH、溫度、氧化還原電位、碳、氮、金屬離子等耐受幅度相對較窄，并且微生物對氣候的變化和人為的擾動更為敏感，即便是很小的環(huán)境改變也能夠顯著的影響湖泊水體的理化性質(zhì)，進(jìn)而使水體微生物生態(tài)系統(tǒng)落組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響水生生態(tài)[2]。微生物的細(xì)菌群落作為一些水生微生物的食物網(wǎng)中的重要組成部分，并且在淡水湖生態(tài)系統(tǒng)中的營養(yǎng)循環(huán)和物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中都發(fā)揮著重要作用[3]。由于淡水湖泊通常在灌木叢附近，很小的外界氣候幅波動都會引起灌木叢線的遷移，同時(shí)會伴隨著一些營養(yǎng)鹽、溶解有機(jī)碳等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入湖泊從而引起關(guān)鍵環(huán)境因子發(fā)生變化，甚至可能會引起湖泊生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生顯著的變化[4]。因此研究細(xì)菌群落時(shí)空分布格局的形成機(jī)制及其對環(huán)境變化的響應(yīng)有助于揭示湖泊生態(tài)系統(tǒng)功能的變化，最終預(yù)測生態(tài)系統(tǒng)對當(dāng)前以及未來環(huán)境變化的響應(yīng)。目前，大量的研究表明在湖泊水體中，細(xì)菌群落的組成和多樣性受到環(huán)境因素的影響，如溫度、pH、一些營養(yǎng)物質(zhì)等。雖然針對環(huán)境變化和時(shí)空變異對水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的相對重要性已有初步研究，但是就極端環(huán)境的淡水湖泊中細(xì)菌群落時(shí)空格局維持機(jī)制的研究還較少[5]。

五大連池位于黑龍江省西北部，地處小興安嶺山地向松嫩平原過渡的地帶，總面積約為1 060 km2[6]。溫泊位于火山區(qū)中心地帶的老黑山南側(cè)熔巖臺地，是五大連池最有特色的湖泊，水源為多個(gè)大小不同的自涌泉，泉水由北向南依次形成麗泊、碧泊、晶泊三個(gè)小型湖泊。溫泊全長約1.8 km，平均水深0.8 m，最深處2 m 左右，麗泊為源頭湖，碧泊面積最大。溫泊為五大連池唯一的不凍湖，水體溫度常年保持在4～14 ℃，溫泊中鐵濃度是五大連池所有水體中含水量最高，并且含有大量營養(yǎng)物質(zhì)供給菌體生長。屬于微小尺度（1～106m3），而目前對于微生物生態(tài)系統(tǒng)的研究多數(shù)集中在較小尺度，對微小尺度的微生物生態(tài)研究較少[7-8]。

基于此，實(shí)驗(yàn)研究擬以五大連池碧泊沉積物中細(xì)菌為研究對象，通過高通量測序技術(shù)、沉積物理化因子分析試圖：（1）分析碧泊沉積物中微生物群落特征；（2）研究碧泊沉積物中環(huán)境因子同細(xì)菌的相關(guān)性。這些問題的解決為研究碧泊沉積物中細(xì)菌的分布特征，從微生物的角度揭示不同影響因素對碧泊沉積物的擾動，為碧泊沉積物的環(huán)境保護(hù)提供重要的資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

硫酸亞鐵銨；37% 鹽酸；98%硫酸；乙酸鈉；冰乙酸；鹽酸羥胺；林菲洛琳；氫氧化鈉；高氯酸；鄰二氮菲；無水乙醇；硫酸高鐵銨；磺基水楊酸；硝酸鉀；引物338F，806R（10D，上海生物工程有限公司）；可溶性總鐵測定試劑盒（廣東還凱微生物科技有限公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物科技有限公司）；dd H2O；瓊脂糖；DNA 提取試劑盒。

1.1.2 儀器

氧化還原測試儀（PHB-4，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；分光光度計(jì)（A003，上海菁華科技儀器有限公司）；電泳儀（YJ300C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；碳氮元素分析儀（mulyi N/2000 型，耶拿，德國）；PCR 儀（2720 型，Applied Biosystems，美國）；Miseq 系統(tǒng)（2500 型，Illumina，英國）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集

溫泊位于五大連池火山區(qū)域，中國北部黑龍江?。∟ 48°35′6.74"，E 126°17′14.15"）。它由碧泊、麗泊、晶泊三個(gè)小湖泊組成，這些小湖泊由一條小溪連接，大部分水來自分布在麗泊湖底部的26 個(gè)左右的泉水。溫泊湖全長1.8 km，平均水深0.8 m，最深水深2 m。碧泊和麗泊湖分別是三個(gè)湖泊中最大和最小的。2017 年10 月（秋季）對碧泊沉積物進(jìn)行了采樣。在碧泊沉積物中取3 個(gè)不同的位置作為大采樣位點(diǎn)，每個(gè)大采樣點(diǎn)由同一經(jīng)緯度的5 個(gè)小采樣位點(diǎn)等比例混合組成，混合后的樣品裝入經(jīng)過滅菌處理的采樣瓶中。物理化學(xué)參數(shù)的樣品分析儲存在4 ℃，分子生物學(xué)分析的樣品儲存在-20 ℃，所有儲存的樣品應(yīng)避免陽光直射。

1.2.2 環(huán)境因子分析

以2.5∶1 的水泥比過濾取上清液，采用帶玻璃電極的數(shù)字pH 計(jì)測量沉積物pH 值。氧化還原測試儀測量氧化還原電位，總鐵用總鐵試劑盒測定，F(xiàn)e（II）和Fe（III）的濃度分別用鄰菲羅啉分光光度法和磺胺水楊酸法測定。TOC 和TON 分別用元素分析儀和過硫酸鉀消解-紫外分光光度法測定。

1.2.3 碧泊沉積物細(xì)菌多樣性分析

碧泊沉積物樣品DNA 的提?。簩⒊练e物樣品用細(xì)菌DNA 提取試劑盒直接進(jìn)行DNA 提取，將提取的DNA 直接作為PCR 模版。PCR 的正向引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′），反向引物為806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），反應(yīng)體系：12.5 μL 的2×Taq PCR Master Mix，上下引物各1 μL，1 μL 的菌液模版，用無菌水補(bǔ)至25 μL。PCR 擴(kuò)增的條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃，40 s、55 ℃，60 s、72 ℃，55 s，30 個(gè)循環(huán)；最后70 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，檢測其濃度和條帶清晰度。檢測合格的樣品進(jìn)行高通量測序，擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA V3+V4 區(qū)片段，高通量測序在北京百邁克生物科技有限公司完成。

1.2.4 碧泊沉積物細(xì)菌多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)采用全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，三次重復(fù)進(jìn)行細(xì)菌多樣性的分析。運(yùn)用CANOCO 5.0 軟件對環(huán)境因子、群落和環(huán)境因子之前進(jìn)行主成成分分析和冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碧泊沉積物環(huán)境因子的測定結(jié)果

碧泊沉積物pH、Eh、ITN、Fe（II）、Fe（III）、TOC 和TON 環(huán)境因子的測定結(jié)果為：pH 為5.15，偏酸性；其Eh 測定結(jié)果為31 mV；其STI 含量為13.05 mg·g-1；Fe（II）含量為8.84 mg·g-1；Fe（III）含量為5.68 mg·g-1；TOC 含量為8.26%；TON 含量為7.18 mg·g-1。

2.2 碧泊沉積物中MTB 多樣性分析

2.2.1 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

Alpha 多樣性是指在細(xì)菌在一個(gè)特定的區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)中的多樣性，它即可以反映物種豐富度也可以反映物種均勻度。Alpha 多樣性主要與物種種類數(shù)目，即豐富度；多樣性，群落中個(gè)體分配上的均勻性有關(guān)。微生物群落的豐富度指數(shù)主要指Chao1 和ACE 指數(shù)。群落多樣性指數(shù)，主要指Shannon 和Simpson 指數(shù)。碧泊沉積物中共獲得135 個(gè)OTU，ACE 指數(shù)為4 261，Chao1 指數(shù)為4 223。而群落多樣性指數(shù)中，Shannon 指數(shù)為5.918 9，Simpson 指數(shù)為0.036 8。圖1 為碧泊沉積物16S rDNA 高通量測序的稀釋曲線圖，從圖中可以看出稀釋曲線已趨于平穩(wěn)，表明該沉積物樣品測序合理，可以反映基本情況。

圖1 碧泊沉積物16S rDNA 基因的稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of 16S rDNA gene in Bibo sediments

2.2.2 碧泊沉積物中細(xì)菌的多樣性組成

通過對碧泊沉積物中細(xì)菌群落組成在OTU 分類水平上的統(tǒng)計(jì)分析，找出碧泊沉積物中細(xì)菌在OTU分類水平中占優(yōu)勢的群落，結(jié)果如圖2。結(jié)果表明，碧泊沉積物共獲得135 個(gè)OTU 分布，其中不動桿菌屬（18.76%）、馬賽菌屬（2.46%）、鐵氧化屬（1.51%）、銅綠假單胞菌屬（1.47%）、百歐博偉屬（1.16%）、地桿菌屬（1.08%）、慢生根瘤菌屬（1.07%）屬于變形菌門，Chryseobacterium sp.（1.72%）屬于擬桿菌門。然而碧泊沉積物中含有大量的未培養(yǎng)和未鑒定的細(xì)菌，這進(jìn)一步說明了樣品中細(xì)菌含量豐富。

圖2 碧泊沉積物的群落組成（a：門水平；b：屬水平）Fig.2 Community composition of Bibo sediments（a：phylum level；b：genus level）

2.3 碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系

采用RDA 分析碧泊沉積物中細(xì)菌的多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系結(jié)果如圖3 所示。由圖可知，酸桿菌門Acdiobacteria、螺旋體菌門Saccharibacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、變形菌門Proteobacteria和Eh、STI 極顯著呈正相關(guān)，伊格納維門Ignavibacteriae、放線菌門Actinbacteria 與Eh、STI 呈正相關(guān)但不顯著。綜上所述，Eh 對碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性影響較為顯著，而STI 對碧泊沉積物多樣性的影響僅次于Eh。

圖3 碧泊沉積物細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子的RDA 分析Fig.3 RDA analysis of bacterial diversity and environmental factors in Bibo sediments

3 討論

對五大連池碧泊沉積物中的7 個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行測定，通過氧化還原電位和pH 的測定結(jié)果顯示碧泊沉積物中氧化還原電位和pH 值與五大連池其他湖泊存在差異，其主要原因可能是由于碧泊湖泊屬于半封閉性水體，其水體與水體之間交換速度較為緩慢，滯留時(shí)間也較長，所以水中溶解氧含量逐漸減少從而大幅度降低了湖泊本身的自凈能力[6]。由于人類活動或者其他因素等產(chǎn)生的外源污染物進(jìn)入湖泊后與水體本身的存在污染物累積從而影響湖泊細(xì)菌菌群的正常代謝，導(dǎo)致厭氧或者兼性厭氧細(xì)菌代謝產(chǎn)物逐漸擴(kuò)散到水體中，進(jìn)而導(dǎo)致水體中氧化還原電位和pH值同其他湖泊位點(diǎn)存在差異[9]。碧泊沉積物中STI、Fe（II）、Fe（III）含量較湖泊中其他湖泊沉積物樣品含量較高，可能是由于其所處于位于火山區(qū)中心地帶的老黑山南側(cè)熔巖臺地的高磁區(qū)域所致。而TOC 和TON含量也較其他湖泊沉積物樣品含量較高，其主要原因可能是由于碧泊沉積物周圍有大面積的灌木叢，從而導(dǎo)致總有機(jī)碳和總有機(jī)氮含量偏高[10]。

碧泊湖泊屬于淺水湖泊，其沉積物中含量最高的細(xì)菌主要為變形菌門。變形菌為碧泊湖泊中細(xì)菌的最有優(yōu)勢的菌群，且碧泊湖泊中所屬于變形菌的微生物主要為不動桿菌屬（18.76%）、馬賽菌屬（2.46%）、鐵氧化屬（1.51%）、假單胞菌屬（1.47%），這些微生物都是在淡水湖泊沉積物中較為常見的菌屬[11]。對五大連池碧泊沉積物的細(xì)菌多樣性研究中，觀察到沉積物中細(xì)菌最豐富的細(xì)菌門類包括變形菌門和擬桿菌門，且該結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室在五大連池不同湖泊沉積物中得出的結(jié)果基本一致[6，12]。由此可見，碧泊沉積物中細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)地域差異不十分明顯。除此之外，碧泊沉積物中含有大量的與鐵還原菌和鐵氧化菌相關(guān)的菌屬，如不動桿菌屬，假單胞菌屬，地桿菌屬等，這也可能是其獨(dú)特的地理位置所致的。地桿菌與厭氧粘細(xì)菌在碧泊沉積物中也為豐度相對較高的細(xì)菌，這一類細(xì)菌有較高的重金屬還原能力，其主要分布于厭氧環(huán)境，并在湖泊中能夠參于一些變價(jià)重金屬的氧化還原、部分放射性金屬元素的穩(wěn)定化以及一些有機(jī)鹵化物的生物代謝過程[13-14]。由于目前金屬污染較嚴(yán)重的淡水湖泊沉積物研究也發(fā)現(xiàn)地桿菌屬和粘細(xì)菌屬在該類湖泊底泥中種類及豐度都十分豐富，研究結(jié)果可看出與之類似，這也表明了還原細(xì)菌可能會存在于金屬濃度較高的環(huán)境中，碧泊沉積物也可能受到了一定程度的重金屬污染[15-16]。

細(xì)菌的群落組成主要由兩個(gè)影響因子組成：內(nèi)部環(huán)境因子和外部環(huán)境因子。其中內(nèi)部環(huán)境因子主要指食物網(wǎng)中生物之間相互作用以及物種本身之間的影響因子，而外部環(huán)境因子主要是指環(huán)境溫度、氧化還原電位、pH、總碳、總氮、重金屬離子濃度等[17]。目前認(rèn)為在沉積物中停留時(shí)間長的細(xì)菌群落主要受一些內(nèi)部環(huán)境因子的影響。研究通過RDA 分析主要細(xì)菌群落與外部環(huán)境因子的關(guān)系，分析結(jié)果表明不同的環(huán)境因子對不同的細(xì)菌群落有著不同影響，而Eh和STI 對碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性影響較為顯著。

近年來，湖泊中的細(xì)菌多樣性及其分布情況有著系統(tǒng)的研究，不同的環(huán)境因子對細(xì)菌的組成及其豐度有著很大的影響。影響湖泊沉積物中細(xì)菌多樣性的因素有很多，比如其所處的地理位置、人類活動、物種間的相互影響以及環(huán)境特異性都可能導(dǎo)致湖泊沉積物中細(xì)菌多樣性的變化[18]。因此，在未來的研究中，一定要綜合考慮外在影響因子和內(nèi)在影響因子對細(xì)菌群落多樣性的影響，更加全面的分析細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子的關(guān)系[19-20]。

4 結(jié)論

通過對碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性及其與環(huán)境因子的關(guān)系進(jìn)行研究，得出：

（1）碧泊沉積物主要由變形菌門和擬桿菌門的細(xì)菌組成，其優(yōu)勢菌群為變形菌門，所占比例為60.23%?；诟咄繑?shù)據(jù)結(jié)果表明，碧泊沉積物中具有較豐富的細(xì)菌多樣性。

（2）通過碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系可知，Eh 對碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性影響較為顯著，而STI 對碧泊沉積物多樣性的影響僅次于Eh。