戰(zhàn)櫟，王偉東，晏磊

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

淡水湖泊中蘊(yùn)含著大量的微生物資源，微生物在淡水湖泊中主要受氣候變化的影響、生物地球化學(xué)循環(huán)的調(diào)控，微生物對(duì)于維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定起著非常重要的作用[1]。相比于海洋微生物，微生物在淡水沉積物中通常對(duì)光照、pH、溫度、氧化還原電位、碳、氮、金屬離子等耐受幅度相對(duì)較窄，并且微生物對(duì)氣候的變化和人為的擾動(dòng)更為敏感，即便是很小的環(huán)境改變也能夠顯著的影響湖泊水體的理化性質(zhì)，進(jìn)而使水體微生物生態(tài)系統(tǒng)落組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響水生生態(tài)[2]。微生物的細(xì)菌群落作為一些水生微生物的食物網(wǎng)中的重要組成部分，并且在淡水湖生態(tài)系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)循環(huán)和物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中都發(fā)揮著重要作用[3]。由于淡水湖泊通常在灌木叢附近，很小的外界氣候幅波動(dòng)都會(huì)引起灌木叢線的遷移，同時(shí)會(huì)伴隨著一些營(yíng)養(yǎng)鹽、溶解有機(jī)碳等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入湖泊從而引起關(guān)鍵環(huán)境因子發(fā)生變化，甚至可能會(huì)引起湖泊生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生顯著的變化[4]。因此研究細(xì)菌群落時(shí)空分布格局的形成機(jī)制及其對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)有助于揭示湖泊生態(tài)系統(tǒng)功能的變化，最終預(yù)測(cè)生態(tài)系統(tǒng)對(duì)當(dāng)前以及未來環(huán)境變化的響應(yīng)。目前，大量的研究表明在湖泊水體中，細(xì)菌群落的組成和多樣性受到環(huán)境因素的影響，如溫度、pH、一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等。雖然針對(duì)環(huán)境變化和時(shí)空變異對(duì)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的相對(duì)重要性已有初步研究，但是就極端環(huán)境的淡水湖泊中細(xì)菌群落時(shí)空格局維持機(jī)制的研究還較少[5]。

五大連池位于黑龍江省西北部，地處小興安嶺山地向松嫩平原過渡的地帶，總面積約為1 060 km2[6]。溫泊位于火山區(qū)中心地帶的老黑山南側(cè)熔巖臺(tái)地，是五大連池最有特色的湖泊，水源為多個(gè)大小不同的自涌泉，泉水由北向南依次形成麗泊、碧泊、晶泊三個(gè)小型湖泊。溫泊全長(zhǎng)約1.8 km，平均水深0.8 m，最深處2 m 左右，麗泊為源頭湖，碧泊面積最大。溫泊為五大連池唯一的不凍湖，水體溫度常年保持在4～14 ℃，溫泊中鐵濃度是五大連池所有水體中含水量最高，并且含有大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給菌體生長(zhǎng)。屬于微小尺度（1～106m3），而目前對(duì)于微生物生態(tài)系統(tǒng)的研究多數(shù)集中在較小尺度，對(duì)微小尺度的微生物生態(tài)研究較少[7-8]。

基于此，實(shí)驗(yàn)研究擬以五大連池碧泊沉積物中細(xì)菌為研究對(duì)象，通過高通量測(cè)序技術(shù)、沉積物理化因子分析試圖：（1）分析碧泊沉積物中微生物群落特征；（2）研究碧泊沉積物中環(huán)境因子同細(xì)菌的相關(guān)性。這些問題的解決為研究碧泊沉積物中細(xì)菌的分布特征，從微生物的角度揭示不同影響因素對(duì)碧泊沉積物的擾動(dòng)，為碧泊沉積物的環(huán)境保護(hù)提供重要的資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

硫酸亞鐵銨；37% 鹽酸；98%硫酸；乙酸鈉；冰乙酸；鹽酸羥胺；林菲洛琳；氫氧化鈉；高氯酸；鄰二氮菲；無水乙醇；硫酸高鐵銨；磺基水楊酸；硝酸鉀；引物338F，806R（10D，上海生物工程有限公司）；可溶性總鐵測(cè)定試劑盒（廣東還凱微生物科技有限公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物科技有限公司）；dd H2O；瓊脂糖；DNA 提取試劑盒。

1.1.2 儀器

氧化還原測(cè)試儀（PHB-4，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；分光光度計(jì)（A003，上海菁華科技儀器有限公司）；電泳儀（YJ300C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；碳氮元素分析儀（mulyi N/2000 型，耶拿，德國(guó)）；PCR 儀（2720 型，Applied Biosystems，美國(guó)）；Miseq 系統(tǒng)（2500 型，Illumina，英國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集

溫泊位于五大連池火山區(qū)域，中國(guó)北部黑龍江?。∟ 48°35′6.74"，E 126°17′14.15"）。它由碧泊、麗泊、晶泊三個(gè)小湖泊組成，這些小湖泊由一條小溪連接，大部分水來自分布在麗泊湖底部的26 個(gè)左右的泉水。溫泊湖全長(zhǎng)1.8 km，平均水深0.8 m，最深水深2 m。碧泊和麗泊湖分別是三個(gè)湖泊中最大和最小的。2017 年10 月（秋季）對(duì)碧泊沉積物進(jìn)行了采樣。在碧泊沉積物中取3 個(gè)不同的位置作為大采樣位點(diǎn)，每個(gè)大采樣點(diǎn)由同一經(jīng)緯度的5 個(gè)小采樣位點(diǎn)等比例混合組成，混合后的樣品裝入經(jīng)過滅菌處理的采樣瓶中。物理化學(xué)參數(shù)的樣品分析儲(chǔ)存在4 ℃，分子生物學(xué)分析的樣品儲(chǔ)存在-20 ℃，所有儲(chǔ)存的樣品應(yīng)避免陽(yáng)光直射。

1.2.2 環(huán)境因子分析

以2.5∶1 的水泥比過濾取上清液，采用帶玻璃電極的數(shù)字pH 計(jì)測(cè)量沉積物pH 值。氧化還原測(cè)試儀測(cè)量氧化還原電位，總鐵用總鐵試劑盒測(cè)定，F(xiàn)e（II）和Fe（III）的濃度分別用鄰菲羅啉分光光度法和磺胺水楊酸法測(cè)定。TOC 和TON 分別用元素分析儀和過硫酸鉀消解-紫外分光光度法測(cè)定。

1.2.3 碧泊沉積物細(xì)菌多樣性分析

碧泊沉積物樣品DNA 的提取：將沉積物樣品用細(xì)菌DNA 提取試劑盒直接進(jìn)行DNA 提取，將提取的DNA 直接作為PCR 模版。PCR 的正向引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′），反向引物為806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），反應(yīng)體系：12.5 μL 的2×Taq PCR Master Mix，上下引物各1 μL，1 μL 的菌液模版，用無菌水補(bǔ)至25 μL。PCR 擴(kuò)增的條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃，40 s、55 ℃，60 s、72 ℃，55 s，30 個(gè)循環(huán)；最后70 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，檢測(cè)其濃度和條帶清晰度。檢測(cè)合格的樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA V3+V4 區(qū)片段，高通量測(cè)序在北京百邁克生物科技有限公司完成。

1.2.4 碧泊沉積物細(xì)菌多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)采用全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，三次重復(fù)進(jìn)行細(xì)菌多樣性的分析。運(yùn)用CANOCO 5.0 軟件對(duì)環(huán)境因子、群落和環(huán)境因子之前進(jìn)行主成成分分析和冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碧泊沉積物環(huán)境因子的測(cè)定結(jié)果

碧泊沉積物pH、Eh、ITN、Fe（II）、Fe（III）、TOC 和TON 環(huán)境因子的測(cè)定結(jié)果為：pH 為5.15，偏酸性；其Eh 測(cè)定結(jié)果為31 mV；其STI 含量為13.05 mg·g-1；Fe（II）含量為8.84 mg·g-1；Fe（III）含量為5.68 mg·g-1；TOC 含量為8.26%；TON 含量為7.18 mg·g-1。

2.2 碧泊沉積物中MTB 多樣性分析

2.2.1 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

Alpha 多樣性是指在細(xì)菌在一個(gè)特定的區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)中的多樣性，它即可以反映物種豐富度也可以反映物種均勻度。Alpha 多樣性主要與物種種類數(shù)目，即豐富度；多樣性，群落中個(gè)體分配上的均勻性有關(guān)。微生物群落的豐富度指數(shù)主要指Chao1 和ACE 指數(shù)。群落多樣性指數(shù)，主要指Shannon 和Simpson 指數(shù)。碧泊沉積物中共獲得135 個(gè)OTU，ACE 指數(shù)為4 261，Chao1 指數(shù)為4 223。而群落多樣性指數(shù)中，Shannon 指數(shù)為5.918 9，Simpson 指數(shù)為0.036 8。圖1 為碧泊沉積物16S rDNA 高通量測(cè)序的稀釋曲線圖，從圖中可以看出稀釋曲線已趨于平穩(wěn)，表明該沉積物樣品測(cè)序合理，可以反映基本情況。

圖1 碧泊沉積物16S rDNA 基因的稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of 16S rDNA gene in Bibo sediments

2.2.2 碧泊沉積物中細(xì)菌的多樣性組成

通過對(duì)碧泊沉積物中細(xì)菌群落組成在OTU 分類水平上的統(tǒng)計(jì)分析，找出碧泊沉積物中細(xì)菌在OTU分類水平中占優(yōu)勢(shì)的群落，結(jié)果如圖2。結(jié)果表明，碧泊沉積物共獲得135 個(gè)OTU 分布，其中不動(dòng)桿菌屬（18.76%）、馬賽菌屬（2.46%）、鐵氧化屬（1.51%）、銅綠假單胞菌屬（1.47%）、百歐博偉屬（1.16%）、地桿菌屬（1.08%）、慢生根瘤菌屬（1.07%）屬于變形菌門，Chryseobacterium sp.（1.72%）屬于擬桿菌門。然而碧泊沉積物中含有大量的未培養(yǎng)和未鑒定的細(xì)菌，這進(jìn)一步說明了樣品中細(xì)菌含量豐富。

圖2 碧泊沉積物的群落組成（a：門水平；b：屬水平）Fig.2 Community composition of Bibo sediments（a：phylum level；b：genus level）

2.3 碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系

采用RDA 分析碧泊沉積物中細(xì)菌的多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系結(jié)果如圖3 所示。由圖可知，酸桿菌門Acdiobacteria、螺旋體菌門Saccharibacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、變形菌門Proteobacteria和Eh、STI 極顯著呈正相關(guān)，伊格納維門Ignavibacteriae、放線菌門Actinbacteria 與Eh、STI 呈正相關(guān)但不顯著。綜上所述，Eh 對(duì)碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性影響較為顯著，而STI 對(duì)碧泊沉積物多樣性的影響僅次于Eh。

圖3 碧泊沉積物細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子的RDA 分析Fig.3 RDA analysis of bacterial diversity and environmental factors in Bibo sediments

3 討論

對(duì)五大連池碧泊沉積物中的7 個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行測(cè)定，通過氧化還原電位和pH 的測(cè)定結(jié)果顯示碧泊沉積物中氧化還原電位和pH 值與五大連池其他湖泊存在差異，其主要原因可能是由于碧泊湖泊屬于半封閉性水體，其水體與水體之間交換速度較為緩慢，滯留時(shí)間也較長(zhǎng)，所以水中溶解氧含量逐漸減少?gòu)亩蠓冉档土撕幢旧淼淖詢裟芰6]。由于人類活動(dòng)或者其他因素等產(chǎn)生的外源污染物進(jìn)入湖泊后與水體本身的存在污染物累積從而影響湖泊細(xì)菌菌群的正常代謝，導(dǎo)致厭氧或者兼性厭氧細(xì)菌代謝產(chǎn)物逐漸擴(kuò)散到水體中，進(jìn)而導(dǎo)致水體中氧化還原電位和pH值同其他湖泊位點(diǎn)存在差異[9]。碧泊沉積物中STI、Fe（II）、Fe（III）含量較湖泊中其他湖泊沉積物樣品含量較高，可能是由于其所處于位于火山區(qū)中心地帶的老黑山南側(cè)熔巖臺(tái)地的高磁區(qū)域所致。而TOC 和TON含量也較其他湖泊沉積物樣品含量較高，其主要原因可能是由于碧泊沉積物周圍有大面積的灌木叢，從而導(dǎo)致總有機(jī)碳和總有機(jī)氮含量偏高[10]。

碧泊湖泊屬于淺水湖泊，其沉積物中含量最高的細(xì)菌主要為變形菌門。變形菌為碧泊湖泊中細(xì)菌的最有優(yōu)勢(shì)的菌群，且碧泊湖泊中所屬于變形菌的微生物主要為不動(dòng)桿菌屬（18.76%）、馬賽菌屬（2.46%）、鐵氧化屬（1.51%）、假單胞菌屬（1.47%），這些微生物都是在淡水湖泊沉積物中較為常見的菌屬[11]。對(duì)五大連池碧泊沉積物的細(xì)菌多樣性研究中，觀察到沉積物中細(xì)菌最豐富的細(xì)菌門類包括變形菌門和擬桿菌門，且該結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室在五大連池不同湖泊沉積物中得出的結(jié)果基本一致[6，12]。由此可見，碧泊沉積物中細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)地域差異不十分明顯。除此之外，碧泊沉積物中含有大量的與鐵還原菌和鐵氧化菌相關(guān)的菌屬，如不動(dòng)桿菌屬，假單胞菌屬，地桿菌屬等，這也可能是其獨(dú)特的地理位置所致的。地桿菌與厭氧粘細(xì)菌在碧泊沉積物中也為豐度相對(duì)較高的細(xì)菌，這一類細(xì)菌有較高的重金屬還原能力，其主要分布于厭氧環(huán)境，并在湖泊中能夠參于一些變價(jià)重金屬的氧化還原、部分放射性金屬元素的穩(wěn)定化以及一些有機(jī)鹵化物的生物代謝過程[13-14]。由于目前金屬污染較嚴(yán)重的淡水湖泊沉積物研究也發(fā)現(xiàn)地桿菌屬和粘細(xì)菌屬在該類湖泊底泥中種類及豐度都十分豐富，研究結(jié)果可看出與之類似，這也表明了還原細(xì)菌可能會(huì)存在于金屬濃度較高的環(huán)境中，碧泊沉積物也可能受到了一定程度的重金屬污染[15-16]。

細(xì)菌的群落組成主要由兩個(gè)影響因子組成：內(nèi)部環(huán)境因子和外部環(huán)境因子。其中內(nèi)部環(huán)境因子主要指食物網(wǎng)中生物之間相互作用以及物種本身之間的影響因子，而外部環(huán)境因子主要是指環(huán)境溫度、氧化還原電位、pH、總碳、總氮、重金屬離子濃度等[17]。目前認(rèn)為在沉積物中停留時(shí)間長(zhǎng)的細(xì)菌群落主要受一些內(nèi)部環(huán)境因子的影響。研究通過RDA 分析主要細(xì)菌群落與外部環(huán)境因子的關(guān)系，分析結(jié)果表明不同的環(huán)境因子對(duì)不同的細(xì)菌群落有著不同影響，而Eh和STI 對(duì)碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性影響較為顯著。

近年來，湖泊中的細(xì)菌多樣性及其分布情況有著系統(tǒng)的研究，不同的環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌的組成及其豐度有著很大的影響。影響湖泊沉積物中細(xì)菌多樣性的因素有很多，比如其所處的地理位置、人類活動(dòng)、物種間的相互影響以及環(huán)境特異性都可能導(dǎo)致湖泊沉積物中細(xì)菌多樣性的變化[18]。因此，在未來的研究中，一定要綜合考慮外在影響因子和內(nèi)在影響因子對(duì)細(xì)菌群落多樣性的影響，更加全面的分析細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子的關(guān)系[19-20]。

4 結(jié)論

通過對(duì)碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性及其與環(huán)境因子的關(guān)系進(jìn)行研究，得出：

（1）碧泊沉積物主要由變形菌門和擬桿菌門的細(xì)菌組成，其優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門，所占比例為60.23%?；诟咄繑?shù)據(jù)結(jié)果表明，碧泊沉積物中具有較豐富的細(xì)菌多樣性。

（2）通過碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系可知，Eh 對(duì)碧泊沉積物中細(xì)菌多樣性影響較為顯著，而STI 對(duì)碧泊沉積物多樣性的影響僅次于Eh。