龍宏燕　梁文英　陳風蔚　王睿勇

摘要：從長年堆積羊毛的土壤中篩選獲得3株具有角蛋白降解功能的菌株，經形態(tài)觀察和16SrRNA測序初步鑒定，并分別命名為鏈霉菌NJU-05、金黃桿菌NJU-07、地衣芽孢桿菌NJU-10。同時，進行液體發(fā)酵工藝優(yōu)化，得到NJU-05菌株實驗室水平的最佳液體發(fā)酵條件：溫度為40℃，pH值為9.0，發(fā)酵周期為3d;NJU-07菌株：溫度為35℃，pH值為9.0，發(fā)酵周期為4d;NJU-10菌株：溫度為35℃，pH值為9.0，發(fā)酵周期為4d。

關鍵詞：羊毛角蛋白;液體發(fā)酵;工藝優(yōu)化;降解菌;篩選鑒定

中圖分類號：S182文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0200-05

作者簡介：龍宏燕（1995—），女，安徽淮南人，碩士研究生，主要從事應用微生物研究。E-mail：longhongyan1995@163.com。

通信作者：王睿勇，博士，副教授，主要從事應用微生物研究。E-mail：wangry@nju.edu.cn。

近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，和我國是革制大國的基本國情，會產生大量的羊毛、皮革加工廢棄物。有統計顯示，我國每年平均產生角蛋白類廢棄物的總量超過400萬t[1]，這些廢棄物由于難于加工且不易降解，大部分未得到合理利用。這類廢棄物大量堆積不僅會造成環(huán)境的嚴重污染，同時也是一種極大的資源浪費[2]。研究羊毛廢棄物的再生利用，不僅可以解決由它引發(fā)的環(huán)境污染問題，而且可以緩解我國蛋白質飼料的供需矛盾，同時在紡織、醫(yī)用生物材料、包裝等諸多領域都有廣闊的前景[3]。

國內外研究表明，微生物及其酶降解法是利用動物角蛋白最經濟有效的手段[4]，且對環(huán)境友好。微生物通過合成角蛋白酶降解角蛋白，其降解角蛋白過程大致可分為3個步驟：變性作用、水解作用和轉氨基作用[5]。目前，已發(fā)現30多種微生物具有降解角蛋白的功能，以細菌、真菌和放線菌為主，其中細菌主要有地衣芽孢桿菌、嗜熱菌、弧菌科細菌;放線菌中大多是鏈霉菌屬[6];真菌主要有長囊頭孢霉菌和皮膚癬菌[7]。

本研究旨在從土壤中分離純化出具有高效羊毛角蛋白降解能力的菌株，并對其液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為大量的廢棄羊毛提供方便高效實用的微生物利用途徑。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1羊毛粉未經酸堿處理的羊毛清水洗凈后在溫度為60℃條件下烘干至恒質量，粉碎機粉碎過篩后備用。

1.1.2培養(yǎng)基BM基礎培養(yǎng)基：1.500gK2HPO4、0.025gMgSO4·7H2O、0.025gCaCl2、0.015gFeSO4·7H2O、0.005gZnSO4·7H2O，1000mL蒸餾水，pH值為7.8～8.0。

羊毛分解能力測試培養(yǎng)基（篩選培養(yǎng)基）：在15mLBM基礎培養(yǎng)基中加入10根完整羊毛。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：50mLBM基礎培養(yǎng)基與0.5g羊毛粉一同裝入250mL錐形瓶中，滅菌備用。

1.2微生物的分離篩選

1.2.1采集樣品在宿遷市泗陽縣168鄉(xiāng)道新袁鎮(zhèn)山羊養(yǎng)殖基地，從羊圈表層、長期堆積羊毛廢棄物處、放牧的農用荒地及羊群活動的地方采集的4種土壤樣品。

1.2.2篩選分離富集培養(yǎng)：在15mLBM基礎培養(yǎng)基中加入1g土壤樣品及適量羊毛，在溫度為37℃條件下培養(yǎng)，觀察羊毛的降解情況。試管中的羊毛發(fā)生降解，且可溶性蛋白檢測有藍色反應，反復轉接，得到富集培養(yǎng)液。

初篩：取富集培養(yǎng)液分別在牛肉膏蛋白胨、高氏Ⅰ號及馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基的平板上稀釋涂布分離，挑選單菌落進一步純化后轉接斜面。37℃活化后，將活化菌接入測試管驗證其對羊毛角蛋白的降解能力，選取有降解能力的菌株保藏備用。

復篩：取1mL初篩得到的活化菌液接種于100mLBM基礎培養(yǎng)液中，于37℃、140r/min搖床培養(yǎng)5d。測定降解率、可溶性蛋白含量及角蛋白酶活性，分析各菌株對羊毛的降解能力。分析比對，從中挑選3株降解率最高的菌株，命名為NJU-05、NJU-07、NJU-10，接入斜面后保藏于4℃冰箱中，備用。

1.3菌種鑒定

分別對NJU-05、NJU-07、NJU-10的菌落進行形態(tài)學觀察、結合16SrRNA基因序列分析進行菌種鑒定。

1.4液體發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接種，以培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)基起始pH值作為主要的參數研究NJU-05、NJU-07、NJU-10對羊毛的降解，其中培養(yǎng)溫度分別設置為25、30、35、40、45℃;培養(yǎng)基起始pH值分別設置為6、7、8、9、10。

1.5發(fā)酵周期

在最適溫度和最適pH值條件下，140r/min搖床培養(yǎng)，每24h取樣1次，測定羊毛降解率、角蛋白酶活性、可溶性蛋白含量[8]，確定最佳發(fā)酵時間。

2結果與分析

2.1羊毛降解菌的篩選分離

2.1.1富集與初篩

采集的土樣進行富集培養(yǎng)后，通過初篩獲得50個生長良好的單菌落。將單菌落轉接入測試管，觀察發(fā)現隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基的顏色逐漸加深，并出現沉淀。說明羊毛逐漸發(fā)生斷裂、降解。據此，篩選得到具有該現象較為明顯的18株菌，并根據所用培養(yǎng)基成分、菌落形態(tài)及鏡檢結果，初步判斷18株菌株中有7株為放線菌，9株為細菌，2株為真菌。

2.1.2復篩

初篩獲得的18株菌進一步發(fā)酵后，取發(fā)酵上清液測定可溶性蛋白含量，以及角蛋白酶活性。同時取濾渣烘干、稱質量，測定降解率。由圖1可知，編號為5、7、10的菌株有相對較高的降解率。編號為5的菌株降解率接近50%;7、10號降解率分別為37.59%、33.7%，超過其他菌株的降解率。同時，可溶性蛋白含量和角蛋白酶活性測定結果顯示5、7、10號菌株也表現出與降解率一致的結果，可溶性蛋白含量及角蛋白酶活性均高于其他菌株。5、7、10號菌株的發(fā)酵液中可溶性蛋白含量較高，均大于120μg/mL。因此本試驗選取角蛋白降解能力較高的3株菌5、7、10號作進一步研究，并將其命名為NJU-05、NJU-07、NJU-10。

2.2菌種鑒定結果

由表1可知，NJU-05油鏡下觀察菌絲發(fā)達，產孢子，為革蘭氏陽性菌;NJU-07菌體呈桿狀，無芽孢，為革蘭氏陰性菌;NJU-10菌體細胞呈短棒狀或桿狀，兩端為圓弧形，產橢圓形芽孢，革蘭氏染色后菌體呈紫色，為革蘭氏陽性菌。

16SrDNA測序結果與GenBank數據庫中發(fā)表的序列進行相似性比對后發(fā)現，該序列與天藍色鏈霉菌（Streptomycescoelicolor）A3（2）染色體相似性高達97%。NJU-07與黃桿菌科細菌（Flavobacteriaceaebacterium）3519-10同源性達到96%，GnenBank登錄號為NC_013062.1。16SrDNA測序結果顯示，NJU-10的16SrDNA基因約1.5kb，GenBank的登錄號為NC006322.1。序列比較分析顯示NJU10與地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）相似性達99%。

結合菌落形態(tài)及16srDNA的鑒定結果，認定NJU-05為鏈霉菌，NJU-07為金黃桿菌屬菌株，NJU-10為地衣芽孢桿菌。

2.3液體發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1培養(yǎng)溫度對液體發(fā)酵的影響

由圖2可知，與對照組相比，NJU-05、NJU-07、NJU-10菌株隨發(fā)酵溫度升高角蛋白降解率逐漸上升，在溫度為35℃時，NJU-07、NJU-10降解率達到最高;在40℃時，NJU-05降解率達到最高?？扇苄缘鞍缀俊⒔堑鞍酌富钚噪S著溫度升高的變化趨勢與降解率一致。說明NJU-07和NJU-10于35℃液體發(fā)酵的最適溫度為35℃，NJU-05的最適溫度為40℃。低于或高于最適溫度，降解率、可溶性蛋白含量及酶活性均有所降低。

pH值也是影響液體發(fā)酵的一個重要因素。由圖3可知，在一定的pH值范圍內，隨著培養(yǎng)基起始pH值的升高，3株菌的降解率、可溶性蛋白含量及酶活性逐漸增加，pH值為9.0時，對3株菌所測定的3個指標均達到峰值，表明它們所產的角蛋白酶是堿性蛋白酶，且較高的堿性條件還能抑制雜菌生長。但過酸或過堿環(huán)境均會影響它們的角蛋白降解能力。

2.3.2發(fā)酵周期確定

由優(yōu)化試驗可知所篩選出的3株菌在實驗室水平下液體發(fā)酵的最優(yōu)條件，其中NJU-05的培養(yǎng)溫度為40℃，pH值為9.0;NJU-10的培養(yǎng)溫度為35℃，pH值為9.0。在此培養(yǎng)條件下，確定發(fā)酵周期。由圖4-a可知，NJU-05在發(fā)酵的前3d內，角蛋白酶活性及可溶性蛋白含量隨著時間的推移逐漸增多，在發(fā)酵后3d均達到最大值，[KG*8]從發(fā)酵后4d起兩者又逐漸下降，這可能是由于細菌生長受到環(huán)境和資源的抑制。角蛋白降解率從發(fā)酵后的1～6d呈持續(xù)上升趨勢，在發(fā)酵2～3d時，增幅最大，而后的幾天在此基礎上雖繼續(xù)降解，但增幅有所減小。所以，發(fā)酵周期以3d為宜。

由圖4-b可知，隨著發(fā)酵時間的延長，NJU-07的各項指標均在增加，在發(fā)酵4d時，角蛋白酶活性出現峰值，而后下降明顯?？扇苄缘鞍缀吭诎l(fā)酵4d時達到峰值。羊毛降解率在發(fā)酵前4d增幅均較明顯，而在發(fā)酵5、6d時，增幅很小，所以，認為發(fā)酵時間為4d最合適。

由圖4-c可知，在接入NJU-10后，角蛋白酶活性在發(fā)酵3d時出現峰值，發(fā)酵4d時略有下降，發(fā)酵5、6d下降明顯?？扇苄缘鞍缀吭诎l(fā)酵4d時增幅最大，且達到峰值。相應地，角蛋白降解率在發(fā)酵前4d增幅均較明顯，而在發(fā)酵5、6d時，增幅均小于5%，此時再繼續(xù)發(fā)酵已無多大意義。綜合各因素，認為發(fā)酵時間為4d最合適。

3結論與討論

從混有羊毛的土樣中，經富集培養(yǎng)和篩選分離得到3株具有較強羊毛角蛋白降解能力的菌株NJU-05、NJU-07、NJU-10。本研究考察液體發(fā)酵溫度和pH值對降解羊毛角蛋白的影響，以確定最優(yōu)的發(fā)酵條件，獲得較高的羊毛角蛋白降解率。通過以上試驗表明，培養(yǎng)溫度為40℃，培養(yǎng)基起始pH值為9.0，發(fā)酵3d時，NJU-05產酶能力最強，降解羊毛角蛋白的效果最優(yōu);NJU-07實驗室水平的最佳液體發(fā)酵條件：溫度為35℃，pH值為9.0，發(fā)酵周期為4d;最適宜NJU-10的液體發(fā)酵條件：溫度為35℃，pH值為9.0，發(fā)酵周期為4d，降解率可達52.8%，在此條件下降解羊毛角蛋白最經濟有效，且在液體發(fā)酵過程中也發(fā)現，角蛋白酶活性與可溶性蛋白含量的變化及角蛋白的降解率變化有一定的對應關系。

本研究為角蛋白廢棄物的生物技術利用提供了理論依據。微生物降解羊毛為工業(yè)化利用開拓了更加經濟的途徑。如果將來能使微生物降解羊毛角蛋白形成一套系統工藝，角蛋白的循壞使用將實現，為此我們還需要對角蛋白酶進一步的純化，并對其理化性質進一步的研究，后續(xù)工作還有待于進一步深入。

參考文獻：

[1]YinJ，RastogiS，TerryAE，etal.Self-organizationofoligopeptidesobtainedondissolutionoffeatherkeratinsinsuperheatedwater[J].Biomacromolecules，2007，8（3）：800-806.

[2]張念榮，王全杰，張琦，等.廢棄羊毛角蛋白的資源化利用研究進展[J].西部皮革，2012，34（24）：29-32.[HJ2.1mm]

[3]王慧玲，周彬.再生羽毛蛋白/PVA共混長絲仿毛面料設計與生產[J].毛紡科技，2015，43（9）：10-13.

[4]WangLY，ChengGY，RenYX，etal.DegradationofintactchickenfeathersbyThermoactinomycessp.CDFandcharacterizationofitskeratinolyticprotease[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2015，99（9）：3949-3959.

[5]GuptaR，RamnaniP.Microbialkeratinasesandtheirprospectiveapplications：anoverview[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2006，70（1）：21-33.

[6]GousterovaA，BraikovaD，GoshevI，etal.Degradationofkeratinandcollagencontainingwastesbynewlyisolatedthermoactinomycetesorbyalkalinehydrolysis[J].LettersinAppliedMicrobiology，2005，40（5）：335-340.

[7]董榮斌，張玲，朱曉飛，等.耐熱鏈霉菌B221降解羽毛角蛋白的固體發(fā)酵條件研究[J].江蘇農業(yè)科學，2007，35（6）：249-251，267.

[8]TomarelliRM，CharneyJ，HardingML.Theuseofazoalbuminasasubstrateinthecolorimetricdeterminationorpepticandtrypticactivity[J].TheJournalofLaboratoryandClinicalMedicine，1949，34（3）：428-433.