楊艷北 許晶 李袁飛

摘要：LuxR家族調(diào)控蛋白調(diào)控革蘭氏陰性細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，從而影響細(xì)菌生物被膜的形成。利用在線生物信息學(xué)預(yù)測軟件，分析LuxR家族調(diào)控蛋白序列，對(duì)其理化性質(zhì)、親水性/疏水性、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析和預(yù)測，為后續(xù)研究生物被膜形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為生物被膜增強(qiáng)劑的開發(fā)提供新的思路。結(jié)果表明：LuxR家族調(diào)控蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白;定位在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中;無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，推斷其為非分泌性蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)元件;α-螺旋和無規(guī)則卷曲對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能發(fā)揮具有重要意義;含有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)包括第79位、第165位和第171位氨基酸，其中蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)包括第90位和第211位氨基酸;無跨膜結(jié)構(gòu)域，推測LuxR家族調(diào)控蛋白不屬于跨膜蛋白;LuxR家族調(diào)控蛋白參與細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為Autoind_bind和 HTH_LUXR，該蛋白通過這2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。

關(guān)鍵詞：沼澤紅假單胞菌;LuxR;生物信息學(xué);生物被膜

沼澤紅假單胞菌是光合細(xì)菌的代表菌株之一，屬于益生菌的一種，廣泛作為動(dòng)物飼料添加劑和水質(zhì)凈化劑使用。沼澤紅假單胞菌自身能夠產(chǎn)生生物被膜[1]，利用生物被膜這一天然保護(hù)狀態(tài)能夠提高細(xì)菌的存活率，增加活菌數(shù)量，穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。生物被膜是指細(xì)菌黏附于接觸物表面而形成的極其復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)，這種復(fù)雜的細(xì)菌聚集體結(jié)構(gòu)，抗逆性強(qiáng)，是大多數(shù)細(xì)菌在自然狀態(tài)下的生長方式。生物被膜使細(xì)菌能夠在惡劣的自然環(huán)境下生存和繁殖。與浮游狀態(tài)下的細(xì)菌相比，生物被膜狀態(tài)下的細(xì)菌具有更強(qiáng)的生存能力，例如抗冷凍能力、抗干燥能力、耐熱性和耐酸性等[2-3]。LuxR家族調(diào)控蛋白是一類在革蘭氏陰性細(xì)菌群體感應(yīng)中起重要作用的調(diào)控蛋白，它們參與由?；呓z氨酸內(nèi)酯介導(dǎo)的多種生物學(xué)過程，包括調(diào)控細(xì)菌生物被膜形成、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、生物發(fā)光以及多種胞外酶、毒力因子和次生代謝產(chǎn)物的合成。LuxR家族調(diào)控蛋白通過群體感應(yīng)系統(tǒng)影響生物被膜的形成[4]。本研究采用生物信息學(xué)的分析方法，對(duì)LuxR家族調(diào)控蛋白的理化性質(zhì)、親水性/疏水性、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析和預(yù)測，為后續(xù)研究沼澤紅假單胞菌生物被膜形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為生物被膜增強(qiáng)劑的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

試驗(yàn)中沼澤紅假單胞菌的LuxR家族調(diào)控蛋白序列來自于美國國家生物信息中心（NCBI）已登錄的序列，蛋白質(zhì)序列編碼為WP_011155889.1（LuxR family transcriptional regulator[Rhodopseudomonas palustris]）。

1.2 研究方法

在線生物信息學(xué)預(yù)測軟件分析LuxR家族調(diào)控蛋白序列（試驗(yàn)時(shí)間：2020年5月，試驗(yàn)地點(diǎn)：江西省南昌市）：利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析理化性質(zhì);利用ProtScale （https：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行親水性、疏水性的分析和預(yù)測;利用PSORTb version 3.0.2 （https：//www.psort.org/psortb/）和LocTree3 （https：//www.rostlab.org/services/loctree3/）進(jìn)行細(xì)菌亞細(xì)胞定位分析和預(yù)測;利用SignalP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）進(jìn)行信號(hào)肽分析和預(yù)測;利用SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/npsa_sopma.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測;利用SWISS-MODEL （https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測;利用NetPhosBac 1.0 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhosBac-1.0）進(jìn)行細(xì)菌蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)分析和預(yù)測;利用TMHMM 2.0 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的分析和預(yù)測;利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析和預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 LuxR理化性質(zhì)分析

利用ProtParam分析LuxR的理化性質(zhì)。LuxR的氨基酸數(shù)量為243個(gè)，其中含量較多的氨基酸為丙氨酸（34個(gè)，14.0%）、亮氨酸（25個(gè)、10.3%），精氨酸（23個(gè)、9.5%）。LuxR的分子量為 26 937.94 u，理論等電點(diǎn)為7.73。LuxR含有4個(gè)半胱氨酸，說明LuxR可能具有二硫鍵。LuxR不含有吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸等稀有氨基酸。LuxR的氨基酸組成分別為丙氨酸（34個(gè)，14.0%）、精氨酸（23個(gè)，9.5%）、天冬酰胺（5個(gè)，2.1%）、天冬氨酸（14個(gè)，5.8%）、半胱氨酸（4個(gè)，1.6%）、谷氨酰胺（4個(gè)，1.6%）、谷氨酸（14個(gè)，5.8%）、甘氨酸（14個(gè)，5.8%）、組氨酸（6個(gè)，25%）、異亮氨酸（14個(gè)，5.8%）、亮氨酸（25個(gè)，10.3%）、賴氨酸（6個(gè)，25%）、甲硫氨酸（5個(gè)，2.1%）、苯丙氨酸（8個(gè)，33%）、脯氨酸（15個(gè)，6.2%）、絲氨酸（15個(gè)，6.2%）、蘇氨酸（11個(gè)，4.5%）、色氨酸（6個(gè)，25%）、酪氨酸（6個(gè)，2.5%）、纈氨酸（14個(gè)，58%）。LuxR帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)（天冬氨酸+谷氨酸）為28個(gè)，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)（精氨酸+賴氨酸）為29個(gè)，其分子式為C1 203H1 897N345O341S9，原子總數(shù)為3 795。假設(shè)LuxR的胱氨酸殘基以半胱氨酸的形式出現(xiàn)，即形成二硫鍵，LuxR的消光系數(shù)為 42 190 L/（mol·cm），吸光度（D280 nm）為1.566;假設(shè)二硫鍵全部打開，LuxR的消光系數(shù)為 41 940 L/（mol·cm），吸光度（D280 nm）為1.557。當(dāng)LuxR的N端為甲硫氨酸時(shí)，在體外培養(yǎng)的網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的半衰期為30 h，在酵母菌細(xì)胞內(nèi)的半衰期大于20 h，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的半衰期大于10 h。LuxR的不穩(wěn)定系數(shù)為42.59，因此推測LuxR為不穩(wěn)定蛋白（蛋白質(zhì)的穩(wěn)定系數(shù)大于閾值40時(shí)，其在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定）。LuxR脂肪指數(shù)為93.29，親水性平均值為-0.075。LuxR親水性平均值為負(fù)值，表明此蛋白為親水性蛋白。

2.2 LuxR親水性/疏水性分析

利用ProtScale分析LuxR的親水性/疏水性。如圖1所示，LuxR多肽鏈中，第103位天冬氨酸和第176位異亮氨酸有最低分值-2.678，親水性最強(qiáng);第204位異亮氨酸和第205位亮氨酸有最高分值2.111，疏水性最強(qiáng);親水性氨基酸數(shù)量較多，且親水性平均值為-0.075，因此LuxR表現(xiàn)為親水性。

2.3 LuxR亞細(xì)胞定位分析

利用PSORTb version 3.0.2分析LuxR的亞細(xì)胞定位。PSORTb v3.0.2是目前最精確的細(xì)菌定位預(yù)測工具之一。LuxR的亞細(xì)胞定位分?jǐn)?shù)分別為：細(xì)胞質(zhì)9.97，細(xì)胞質(zhì)膜0.01，周質(zhì)0.01，外膜0.00，細(xì)胞外0.00。定位分?jǐn)?shù)顯示LuxR定位在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中。利用LocTree3分析LuxR的亞細(xì)胞定位。由圖2可見，LuxR定位在細(xì)胞質(zhì)中，亞細(xì)胞定位分?jǐn)?shù)95，精確度98%。基于上述2種在線軟件的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，LuxR定位在細(xì)胞質(zhì)中。

2.4 LuxR信號(hào)肽分析

利用SignalP 4.1 Server分析LuxR的信號(hào)肽。由圖3可見，原始剪切位點(diǎn)C最大值在第55個(gè)氨基酸，分?jǐn)?shù)為 0.154;綜合剪切位點(diǎn)Y最大值在第55個(gè)氨基酸，分?jǐn)?shù)為0.154;信號(hào)肽S最大值在第42個(gè)氨基酸，分?jǐn)?shù)為0.257;平均信號(hào)肽S值在第1～54個(gè)氨基酸之間，平均值是0.107;D值在第1～54個(gè)氨基酸之間，平均值是0.132;臨界值是0.570。D值是信號(hào)肽S最大值和綜合剪切位點(diǎn)Y最大值的平均值，對(duì)區(qū)分是否為分泌蛋白具有至關(guān)重要的作用。D值小于臨界值，LuxR未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列，因此推斷LuxR為非分泌性蛋白。

2.5 LuxR二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA分析LuxR的二級(jí)結(jié)構(gòu)。由圖4可見，LuxR可能包含的二級(jí)結(jié)構(gòu)分別為：α-螺旋（藍(lán)色）115個(gè)，占47.33%;β-轉(zhuǎn)角（綠色）14個(gè)，占5.76%;延伸鏈（紅色）30個(gè)，占12.35%;無規(guī)則卷曲（紫色）84個(gè)，占34.57%。α-螺旋及無規(guī)則卷曲是LuxR二級(jí)結(jié)構(gòu)中最大量的結(jié)構(gòu)元件。

2.6 LuxR三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SWISS-MODEL分析LuxR三級(jí)結(jié)構(gòu)，得到6個(gè)預(yù)測模型，其中以PDB ID：2q0o.1.A為模板

的預(yù)測模型質(zhì)量最高，作為本研究中的LuxR預(yù)測模型。由圖5可見，LuxR預(yù)測模型與模板序列相似度為24.11%。在本研究中，LuxR預(yù)測模型的全局模型質(zhì)量評(píng)估分?jǐn)?shù)（GMQE）為0.64，明顯高于其他預(yù)測模型，更接近1。GMQE是一種質(zhì)量評(píng)估方法，生成的GMQE在0到1之間，數(shù)字越高，越接近1表明可靠性越高。在本研究中，LuxR預(yù)測模型的QMEAN分?jǐn)?shù)為-2.45，比其他預(yù)測模型更接近0。QMEAN分?jǐn)?shù)在0左右，表明模型結(jié)構(gòu)與試驗(yàn)結(jié)構(gòu)具有良好的一致性。QMEAN分?jǐn)?shù)在-4.0以下表示模型質(zhì)量較低。通過SWISS-MODEL預(yù)測得出LuxR的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6），可見其α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)豐富，數(shù)量較多。推測α-螺旋和無規(guī)則卷曲對(duì)LuxR三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能發(fā)揮具有重要意義。

2.7 LuxR磷酸化位點(diǎn)分析

利用NetPhosBac 1.0 server分析LuxR的磷酸化位點(diǎn)。由圖7可見，磷酸化位點(diǎn)有5個(gè)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)包括：第79位氨基酸（殘基得分：0721），第165位氨基酸（殘基得分：0.635），第171位氨基酸（殘基得分：0.573）;蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)包括：第90位氨基酸（殘基得分：0.545），第211位氨基酸（殘基得分：0.516）。殘基得分介于0和1之間，當(dāng)?shù)梅指哂?.5時(shí)，殘基被預(yù)測為磷酸化位點(diǎn)。

2.8 LuxR跨膜結(jié)構(gòu)域分析

利用TMHMM 2.0 server分析LuxR的跨膜結(jié)構(gòu)域。如圖8所示，預(yù)測LuxR位于膜外（粉色細(xì)線）的概率接近100%，位于膜內(nèi)（藍(lán)色細(xì)線）和跨膜區(qū)域（紅色細(xì)線）的概率幾乎為0。粉色粗線代表多肽鏈中跨膜區(qū)域所在位置。因LuxR無跨膜結(jié)構(gòu)域，所以圖中不顯示相應(yīng)的標(biāo)記，推測LuxR不屬于跨膜蛋白。

2.9 LuxR功能結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，LuxR參與細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)。由圖9可見，LuxR在第27～167位氨基酸處含有保守結(jié)構(gòu)域Autoind_bind，該結(jié)構(gòu)域與自誘導(dǎo)物分子能夠特異性結(jié)合，屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子超家族;LuxR在180～235位氨基酸處含有保守結(jié)構(gòu)域HTH_LUXR，該結(jié)構(gòu)域與DNA特異性結(jié)合，起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用，屬于α-螺旋蛋白結(jié)構(gòu)域超家族。因此，LuxR通過Autoind_bind和HTH_LUXR 2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。

3 討論與結(jié)論

沼澤紅假單胞菌屬于益生菌的一種，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖、農(nóng)作物種植及污水處理方面表現(xiàn)出極高的應(yīng)用價(jià)值[5]。益生菌的發(fā)展經(jīng)過4個(gè)階段：第1代益生菌為不經(jīng)包被處理的菌株，以浮游狀態(tài)或冷凍干燥狀態(tài)存在;第2代益生菌為藥用膠囊包被的冷凍干燥菌體;第3代益生菌為莢膜包被或微膠囊制備的菌劑;近幾年，第4代益生菌的研發(fā)正在蓬勃興起，其主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)就在于生物被膜狀態(tài)下的益生菌制備和微膠囊技術(shù)的換代升級(jí)[3，5]。在此研究的大背景下，本研究采用生物信息學(xué)的分析方法，對(duì)沼澤紅假單胞菌生物被膜形成過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白LuxR的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行預(yù)測，為后續(xù)研究沼澤紅假單胞菌生物被膜形成機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，LuxR家族調(diào)控蛋白參與細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)。細(xì)菌群體感應(yīng)現(xiàn)象是指細(xì)菌數(shù)量達(dá)到一定閾值，同時(shí)信號(hào)分子的濃度也達(dá)到一定的水平，細(xì)菌之間通過信號(hào)分子進(jìn)行交流，從而調(diào)控自身生理特征，并改變自身生理狀態(tài)的一種現(xiàn)象。細(xì)菌之間存在大量的信息交流和溝通，細(xì)菌不是完全獨(dú)立的個(gè)體[6-7]。LuxR系統(tǒng)作為革蘭氏陰性細(xì)菌中普遍存在的一種群體感應(yīng)系統(tǒng)，在細(xì)菌的生存和繁衍過程中發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用，例如：LuxR家族調(diào)控蛋白通過群體感應(yīng)系統(tǒng)影響生物被膜的形成，增強(qiáng)其對(duì)抗外界惡劣自然環(huán)境的能力[8-9]。LuxR家族調(diào)控蛋白能夠與?；呓z氨酸內(nèi)酯結(jié)合，形成活性分子進(jìn)而啟動(dòng)下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[7，10-11]。LuxR型蛋白的N端為信號(hào)分子?；呓z氨酸內(nèi)酯的結(jié)合區(qū)域，C端含有保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，能夠與目的基因特異性結(jié)合[4，12]，本研究中的LuxR家族調(diào)控蛋白也具有類似的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。雖然LuxR的高級(jí)結(jié)構(gòu)大致相同，但是LuxR的一級(jí)結(jié)構(gòu)差異明顯。不同種屬的微生物之間，LuxR一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列差異較大，具有較多的替代氨基酸[4]。LuxR家族調(diào)控蛋白作為生物被膜形成過程中的關(guān)鍵蛋白[13]，是理想的生物被膜增強(qiáng)劑的候選蛋白，因此，通過不斷對(duì)其進(jìn)行深入研究和分析，對(duì)生物被膜的人為控制將具有非常良好的誘人前景。本研究采用生物信息學(xué)的分析方法，對(duì)沼澤紅假單胞菌LuxR家族調(diào)控蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行預(yù)測，為生物被膜增強(qiáng)劑的開發(fā)提供了新的思路。

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