對氨甲苯酸注射液中特定雜質(zhì)4-甲?；郊姿岬难芯?/h1>
2021-05-06 07:35:58張耀文于明李沫孫苓苓遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心沈陽110036遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院沈陽110036
中南藥學(xué) 2021年4期
張耀文，于明，李沫，孫苓苓*（1.遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心，沈陽 110036；2.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院，沈陽 110036）
氨甲苯酸（aminomethylbenzoic acid monohydrate），又稱止血芳酸，化學(xué)名為對氨甲基苯甲酸一水合物，分子式為C8H9NO2·H2O。氨甲苯酸是一種抗纖溶止血藥，國內(nèi)于1968年開始生產(chǎn)。氨甲苯酸臨床上主要用于原發(fā)性纖維蛋白過度溶解所引起的出血，包括急性和慢性、局限性或全身性的高纖溶出血的治療[1-2]。本次國家計(jì)劃抽驗(yàn)的品種氨甲苯酸注射液共抽樣153 批，執(zhí)行《中國藥典》1995年版二部標(biāo)準(zhǔn)和國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)，《中國藥典》2020年版和國外藥典均未收載。
藥品中的有關(guān)物質(zhì)是否能得到合理、有效的控制，直接關(guān)系到其質(zhì)量的可控性與安全性。本次總計(jì)153 批次的氨甲苯酸注射液按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，結(jié)果均符合規(guī)定，其中4 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的樣品（約占36%）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中無有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，不能評價(jià)制劑中工藝雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的情況。目前國內(nèi)僅有少量文獻(xiàn)對氨甲苯酸注射液的有關(guān)物質(zhì)測定方法進(jìn)行研究[3-6]，未有文獻(xiàn)針對氨甲苯酸中的雜質(zhì)進(jìn)行過定性鑒別及定量測定。超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)（UHPLC-Q Exactive Focus MS）結(jié)合了超高效液相色譜的高分離能力和高分辨質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性、高分辨率等檢測優(yōu)勢，可獲得豐富有效的化合物多級質(zhì)譜、精確相對分子質(zhì)量等信息，保證了結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[7-10]。本試驗(yàn)采用2020年3月頒布的氨甲苯酸注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS1-（YH-002）-1995-2020 中的色譜條件，對153 批樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，利用半制備柱從樣品中制備雜質(zhì)，并建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 方法對雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及定量分析，進(jìn)一步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期對本品的安全性進(jìn)行全面評價(jià)。
1 儀器與試藥
Waters e2695 液相色譜儀、Waters 2487 液相色譜儀、Waters 2998 UVD 檢測器（美國Waters 公司）；BUCHI R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；Vanquish 超高效液相色譜儀、四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀、結(jié)構(gòu)解析軟件Mass Frontier（美國Thermo公 司）；XP205型電子分析天平、S400 Seven excellent 型pH 計(jì)（瑞士Mettler-Toledo 公司）；小分子未知物定性軟件Compound Discoverer（美國Thermo 公司）。
氨甲苯酸注射液為國家評價(jià)性抽驗(yàn)樣品，共153 批，涉及9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)；4-甲?；郊姿幔ㄅ?hào)：MKLB 3894V，SIGMA-ALDRICH，純度：98.5%）；氨甲苯酸對照品（批號(hào)：100921-201702，中國食品藥品檢定研究院，純度：97.8%）；氨甲苯酸原料藥（湖南洞庭藥業(yè)，純度：99.9%，批號(hào)：W1903010），乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。
2 方法與結(jié)果
2.1 有關(guān)物質(zhì)的檢測與制備
2.1.1 有關(guān)物質(zhì)色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（磷酸氫二鈉11.0 g，辛烷磺酸鈉1.0 g，加水800 mL 使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.52，加水至900 mL）-乙腈（88∶12）；柱溫：40 ℃；流速：1 mL·min－1；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測波長：230 nm。
2.1.2 有關(guān)物質(zhì)溶液的配制 精密量取氨甲苯酸注射液樣品1 mL 置25 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密稱取氨甲苯酸原料藥10 mg 置25 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
2.1.3 有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果及分析 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，氨甲苯酸注射液及原料藥典型圖譜見圖1。
圖1 氨甲苯酸注射液（A、B）和原料藥（C）色譜圖Fig 1 Chromatogram of aminomethylbenzoic acid injection sample（A、B）and API（C）
在A 企業(yè)氨甲苯酸注射液有關(guān)物質(zhì)色譜圖中，與主成分峰相對保留時(shí)間約為1.83 的雜質(zhì)峰1 峰面積大于對照溶液主峰面積（0.1%），超出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最大單個(gè)雜質(zhì)限度。該雜質(zhì)的PDA 光譜圖顯示，其紫外最大吸收波長為254 nm，在230 nm 檢測時(shí)，該雜質(zhì)被低估，見圖2。通過與原料藥色譜圖對比，發(fā)現(xiàn)氨甲苯酸注射液色譜圖中該雜質(zhì)的含量高于原料藥，為注射液中特定的雜質(zhì)。
圖2 氨甲苯酸峰與雜質(zhì)峰1 光譜圖Fig 2 Spectra of aminomethylbenzoic acid and impurity 1
2.1.4 半制備色譜條件 半制備色譜柱：Diamonsil C18（2）（250 mm×10.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：20 mmol·L－1醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0）-甲醇（80∶20）；柱溫：35℃；流速：2 mL·min－1；進(jìn)樣體積：1 mL；檢測波長：254 nm。
2.1.5 有關(guān)物質(zhì)的制備 取A 企業(yè)樣品，精密吸取1 mL，注入色譜儀，按“2.1.4”項(xiàng)下方法測定，收集目標(biāo)流份，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，用少量乙醇轉(zhuǎn)移至小瓶中，重結(jié)晶，即得。
2.2 LC-MS 定性鑒別
2.2.1 LC-MS 色譜條件 色譜柱：Thermo Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）； 流動(dòng)相：20 mmol·L－1醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0）-甲醇（80∶20）；柱溫：35℃；流速：0.5 mL·min－1；進(jìn)樣體積：2 μL；檢測波長：254 nm。
噴霧電壓：3500 V，霧化溫度：350℃，鞘氣壓力：45 arb，輔助氣壓力：15 arb，離子傳輸管溫度：320℃，掃描模式：Full Scan-ddms2，掃描范圍：m/z75 ～750，分辨率：70 000 ～17 500。
2.2.2 LC-MS 定性鑒別結(jié)果 利用UHPLC-Q Exactive Focus MS 對雜質(zhì)的一、二級質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，確定化合物及二級碎片裂解規(guī)律。
一級質(zhì)譜圖給出分子離子峰m/z149.02442，二級質(zhì)譜可見兩個(gè)碎片離子峰（m/z105.03459和m/z121.02950），運(yùn)用Mass Frontier 軟件輔助Compound Discoverer 軟件，對該化合物的碎片結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸屬，推測該雜質(zhì)為4-甲酰基苯甲酸。質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖3～4。
圖3 4-甲?；郊姿犭x子流圖和質(zhì)譜圖Fig 3 EIC and mass spectrum of 4-formylbenzoic acid
圖4 4-甲?；郊姿崴槠呀馔緩紽ig 4 Fragmentation pathway of 4-formylbenzoic acid
2.3 4-甲酰基苯甲酸的結(jié)構(gòu)確定
按“2.1.5”項(xiàng)下方法半制備獲得的目標(biāo)雜質(zhì)與4-甲?；郊姿釋φ掌芬合嗌V一致，確定該雜質(zhì)為4-甲?；郊姿幔ㄒ妶D5）。
測定不同比例反應(yīng)后的納米顆粒以及反應(yīng)前脂質(zhì)體Zeta電位，重復(fù)測三次；動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（DLS）測定脂質(zhì)體粒徑；透射電鏡（TEM）觀察脂質(zhì)體形態(tài)，取陽離子脂質(zhì)體質(zhì)量：siRNA質(zhì)量為5:1的樣品組，直接滴加在銅網(wǎng)上，靜置空氣中干燥30 min后測試。
圖5 4-甲酰基苯甲酸對照品（A）和制備雜質(zhì)樣品（B）色譜圖Fig 5 HPLC chromatogram of 4-formyl benzoic acid standard（A）and prepared impurity（B）
3 方法學(xué)驗(yàn)證
3.1 專屬性
精密稱取氨甲苯酸對照品和4-甲?；郊姿釋φ掌愤m量，加流動(dòng)相制成含氨甲苯酸為20 μg·mL－1及4-甲?；郊姿釣?0 μg·mL－1的系統(tǒng)適用性溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果表明主成分氨甲苯酸與雜質(zhì)4-甲?；郊姿徇_(dá)到良好分離，空白溶液不干擾主成分和雜質(zhì)的測定。
3.2 線性范圍與校正因子考察
精密稱取氨甲苯酸對照品適量，用流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度分別為1.10、4.40、5.50、11.1、44.0 和55.0 ng·mL－1的系列對照品溶液。精密稱取4-甲?；郊姿徇m量，用流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度分別為1.22、4.88、6.10、12.2、48.8 和61.0 ng·mL－1的系列對照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各雜質(zhì)的質(zhì)量濃度（C，ng·mL－1）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果線性方程氨甲苯酸為Y＝4855X－44.21，r＝1.000；4-甲酰基苯甲酸為Y＝1687X－330.5，r＝1.000。采用主成分與雜質(zhì)線性方程斜率比較法計(jì)算4-甲酰基苯甲酸的校正因子f＝2.88。
3.3 重復(fù)性試驗(yàn)
精密量取A 企業(yè)氨甲苯酸注射液1 mL 置25 mL 量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，4-甲?；郊姿岬暮縍SD為0.44%，表明方法重復(fù)性良好。
3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)
精密稱取4-甲?；郊姿釋φ掌?0.14、20.19 和30.37 mg，分別置250 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成50%、100%、150% 3 個(gè)濃度水平的對照品溶液，精密量取1 mL，置25 mL 量瓶中，各3 份。再精密量取B 企業(yè)氨甲苯酸注射液1 mL 置上述25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，4-甲酰基苯甲酸回收率為97.85 ～102.6%，RSD為1.4%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。
3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，于0、2、4、8 和10 h 分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果樣品中雜質(zhì)峰面積RSD為0.50%，表明4-甲?；郊姿嵩?0 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
3.6 4-甲?；郊姿岬臋z測限和定量限
分別以3 倍和10 倍信噪比（S/N）測定方法的檢測限和定量限，得4-甲?；郊姿釞z測限和定量限分別為0.27 ng·mL－1和1.07 ng·mL－1。
3.7 加校正因子的主成分自身對照法與外標(biāo)法比較
精密吸取“3.3”項(xiàng)下樣品溶液1 mL 置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，再精取1 mL 置20 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。
精密稱取4-甲酰基苯甲酸20.19 mg 置250 mL量瓶中，加甲醇10 mL 使之溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精取0.25 mL 置25 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。分別吸取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表1。加校正因子的主成分自身對照法與外標(biāo)法測定結(jié)果一致，可以采用加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算樣品中4-甲?；郊姿岬暮俊?/p>
表1 加校正因子的主成分自身對照法與外標(biāo)法測定結(jié)果Tab 1 Main component self-compare with orrection factor method and external standard method
3.8 樣品有關(guān)物質(zhì)測定
按有關(guān)物質(zhì)檢查方法，對9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)153批氨甲苯酸注射液的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行考察。結(jié)果表明5 個(gè)企業(yè)101 批樣品未檢出4-甲酰苯甲酸，2個(gè)企業(yè)38 批樣品中4-甲酰苯甲酸含量小于0.2%，2個(gè)企業(yè)14批樣品中4-甲酰苯甲酸含量大于0.2%。
4 討論
4.1 半制備色譜條件和色譜-質(zhì)譜條件的確定
為建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 方法對雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，本試驗(yàn)在WS1-（YH-002）-1995-2020 標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)色譜條件的基礎(chǔ)上，采用醋酸銨溶液代替了磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)相為20 mmol·L－1醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0）-甲醇（80∶20）時(shí)，基線穩(wěn)定，空白溶劑對于測定無干擾，并且在該流動(dòng)相下，在半制備液相中，氨甲苯酸與4-甲酰苯甲酸能達(dá)到良好分離，便于收集目標(biāo)雜質(zhì)。
4.2 有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)修訂
采用氨甲苯酸注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS1-（YH-002）-1995-2020 中有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)色譜條件對氨甲苯酸注射液中雜質(zhì)情況進(jìn)行深入研究，該方法優(yōu)于各企業(yè)現(xiàn)行注冊標(biāo)準(zhǔn)。在本項(xiàng)探索性研究中定性了氨甲苯酸注射液中雜質(zhì)4-甲酰基苯甲酸，紫外最大吸收波長為254 nm，在230 nm 的檢測波長下校正因子為2.88，因此需按加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算其含量。
結(jié)合樣品測定結(jié)果及ICH Q3B（R）關(guān)于日最大劑量在100 mg ～2 g 的制劑（本品為0.6 g）中雜質(zhì)的質(zhì)控限度[11]，擬定雜質(zhì)限度為0.2%。
4.3 雜質(zhì)4-甲?；郊姿岙a(chǎn)生機(jī)制
通過與氨甲苯酸原料藥有關(guān)物質(zhì)色譜圖比較，有的企業(yè)生產(chǎn)的注射液中4-甲?；郊姿岬暮窟h(yuǎn)遠(yuǎn)高于原料藥，氨甲苯酸注射液與氨甲苯酸原料中的4-甲酰基苯甲酸產(chǎn)生途徑不同，該雜質(zhì)在原料藥中來自對甲基苯甲酸氯化副產(chǎn)物，注射液中的4-甲?；郊姿峥赡芘c注射液生產(chǎn)工藝和在某種條件下（光、熱和氧的作用）的降解有關(guān)。推測其產(chǎn)生機(jī)制如圖6所示。
圖6 氨甲苯酸產(chǎn)生機(jī)制Fig 6 Production mechanism of aminomethylbenzoic acid
5 結(jié)論
本試驗(yàn)對氨甲苯酸注射液中的特定雜質(zhì)進(jìn)行研究，半制備柱從樣品中制備雜質(zhì)，建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 法對樣品中的雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定該雜質(zhì)為4-甲酰基苯甲酸，并對方法的有效性進(jìn)行了評價(jià)，計(jì)算出該雜質(zhì)的相對校正因子，對現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂，進(jìn)一步完善氨甲苯酸注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以對本品的安全性進(jìn)行全面評價(jià)，為氨甲苯酸注射液的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。
張耀文，于明，李沫，孫苓苓*（1.遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心，沈陽 110036；2.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院，沈陽 110036）
氨甲苯酸（aminomethylbenzoic acid monohydrate），又稱止血芳酸，化學(xué)名為對氨甲基苯甲酸一水合物，分子式為C8H9NO2·H2O。氨甲苯酸是一種抗纖溶止血藥，國內(nèi)于1968年開始生產(chǎn)。氨甲苯酸臨床上主要用于原發(fā)性纖維蛋白過度溶解所引起的出血，包括急性和慢性、局限性或全身性的高纖溶出血的治療[1-2]。本次國家計(jì)劃抽驗(yàn)的品種氨甲苯酸注射液共抽樣153 批，執(zhí)行《中國藥典》1995年版二部標(biāo)準(zhǔn)和國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)，《中國藥典》2020年版和國外藥典均未收載。
藥品中的有關(guān)物質(zhì)是否能得到合理、有效的控制，直接關(guān)系到其質(zhì)量的可控性與安全性。本次總計(jì)153 批次的氨甲苯酸注射液按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，結(jié)果均符合規(guī)定，其中4 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的樣品（約占36%）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中無有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，不能評價(jià)制劑中工藝雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的情況。目前國內(nèi)僅有少量文獻(xiàn)對氨甲苯酸注射液的有關(guān)物質(zhì)測定方法進(jìn)行研究[3-6]，未有文獻(xiàn)針對氨甲苯酸中的雜質(zhì)進(jìn)行過定性鑒別及定量測定。超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)（UHPLC-Q Exactive Focus MS）結(jié)合了超高效液相色譜的高分離能力和高分辨質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性、高分辨率等檢測優(yōu)勢，可獲得豐富有效的化合物多級質(zhì)譜、精確相對分子質(zhì)量等信息，保證了結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[7-10]。本試驗(yàn)采用2020年3月頒布的氨甲苯酸注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS1-（YH-002）-1995-2020 中的色譜條件，對153 批樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，利用半制備柱從樣品中制備雜質(zhì)，并建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 方法對雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及定量分析，進(jìn)一步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期對本品的安全性進(jìn)行全面評價(jià)。
1 儀器與試藥
Waters e2695 液相色譜儀、Waters 2487 液相色譜儀、Waters 2998 UVD 檢測器（美國Waters 公司）；BUCHI R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；Vanquish 超高效液相色譜儀、四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀、結(jié)構(gòu)解析軟件Mass Frontier（美國Thermo公 司）；XP205型電子分析天平、S400 Seven excellent 型pH 計(jì)（瑞士Mettler-Toledo 公司）；小分子未知物定性軟件Compound Discoverer（美國Thermo 公司）。
氨甲苯酸注射液為國家評價(jià)性抽驗(yàn)樣品，共153 批，涉及9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)；4-甲?；郊姿幔ㄅ?hào)：MKLB 3894V，SIGMA-ALDRICH，純度：98.5%）；氨甲苯酸對照品（批號(hào)：100921-201702，中國食品藥品檢定研究院，純度：97.8%）；氨甲苯酸原料藥（湖南洞庭藥業(yè)，純度：99.9%，批號(hào)：W1903010），乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。
2 方法與結(jié)果
2.1 有關(guān)物質(zhì)的檢測與制備
2.1.1 有關(guān)物質(zhì)色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（磷酸氫二鈉11.0 g，辛烷磺酸鈉1.0 g，加水800 mL 使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.52，加水至900 mL）-乙腈（88∶12）；柱溫：40 ℃；流速：1 mL·min－1；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測波長：230 nm。
2.1.2 有關(guān)物質(zhì)溶液的配制 精密量取氨甲苯酸注射液樣品1 mL 置25 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密稱取氨甲苯酸原料藥10 mg 置25 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
2.1.3 有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果及分析 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，氨甲苯酸注射液及原料藥典型圖譜見圖1。
圖1 氨甲苯酸注射液（A、B）和原料藥（C）色譜圖Fig 1 Chromatogram of aminomethylbenzoic acid injection sample（A、B）and API（C）
在A 企業(yè)氨甲苯酸注射液有關(guān)物質(zhì)色譜圖中，與主成分峰相對保留時(shí)間約為1.83 的雜質(zhì)峰1 峰面積大于對照溶液主峰面積（0.1%），超出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最大單個(gè)雜質(zhì)限度。該雜質(zhì)的PDA 光譜圖顯示，其紫外最大吸收波長為254 nm，在230 nm 檢測時(shí)，該雜質(zhì)被低估，見圖2。通過與原料藥色譜圖對比，發(fā)現(xiàn)氨甲苯酸注射液色譜圖中該雜質(zhì)的含量高于原料藥，為注射液中特定的雜質(zhì)。
圖2 氨甲苯酸峰與雜質(zhì)峰1 光譜圖Fig 2 Spectra of aminomethylbenzoic acid and impurity 1
2.1.4 半制備色譜條件 半制備色譜柱：Diamonsil C18（2）（250 mm×10.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：20 mmol·L－1醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0）-甲醇（80∶20）；柱溫：35℃；流速：2 mL·min－1；進(jìn)樣體積：1 mL；檢測波長：254 nm。
2.1.5 有關(guān)物質(zhì)的制備 取A 企業(yè)樣品，精密吸取1 mL，注入色譜儀，按“2.1.4”項(xiàng)下方法測定，收集目標(biāo)流份，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，用少量乙醇轉(zhuǎn)移至小瓶中，重結(jié)晶，即得。
2.2 LC-MS 定性鑒別
2.2.1 LC-MS 色譜條件 色譜柱：Thermo Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）； 流動(dòng)相：20 mmol·L－1醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0）-甲醇（80∶20）；柱溫：35℃；流速：0.5 mL·min－1；進(jìn)樣體積：2 μL；檢測波長：254 nm。
噴霧電壓：3500 V，霧化溫度：350℃，鞘氣壓力：45 arb，輔助氣壓力：15 arb，離子傳輸管溫度：320℃，掃描模式：Full Scan-ddms2，掃描范圍：m/z75 ～750，分辨率：70 000 ～17 500。
2.2.2 LC-MS 定性鑒別結(jié)果 利用UHPLC-Q Exactive Focus MS 對雜質(zhì)的一、二級質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，確定化合物及二級碎片裂解規(guī)律。
一級質(zhì)譜圖給出分子離子峰m/z149.02442，二級質(zhì)譜可見兩個(gè)碎片離子峰（m/z105.03459和m/z121.02950），運(yùn)用Mass Frontier 軟件輔助Compound Discoverer 軟件，對該化合物的碎片結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸屬，推測該雜質(zhì)為4-甲酰基苯甲酸。質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖3～4。
圖3 4-甲?；郊姿犭x子流圖和質(zhì)譜圖Fig 3 EIC and mass spectrum of 4-formylbenzoic acid
圖4 4-甲?；郊姿崴槠呀馔緩紽ig 4 Fragmentation pathway of 4-formylbenzoic acid
2.3 4-甲酰基苯甲酸的結(jié)構(gòu)確定
按“2.1.5”項(xiàng)下方法半制備獲得的目標(biāo)雜質(zhì)與4-甲?；郊姿釋φ掌芬合嗌V一致，確定該雜質(zhì)為4-甲?；郊姿幔ㄒ妶D5）。
測定不同比例反應(yīng)后的納米顆粒以及反應(yīng)前脂質(zhì)體Zeta電位，重復(fù)測三次；動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（DLS）測定脂質(zhì)體粒徑；透射電鏡（TEM）觀察脂質(zhì)體形態(tài)，取陽離子脂質(zhì)體質(zhì)量：siRNA質(zhì)量為5:1的樣品組，直接滴加在銅網(wǎng)上，靜置空氣中干燥30 min后測試。
圖5 4-甲酰基苯甲酸對照品（A）和制備雜質(zhì)樣品（B）色譜圖Fig 5 HPLC chromatogram of 4-formyl benzoic acid standard（A）and prepared impurity（B）
3 方法學(xué)驗(yàn)證
3.1 專屬性
精密稱取氨甲苯酸對照品和4-甲?；郊姿釋φ掌愤m量，加流動(dòng)相制成含氨甲苯酸為20 μg·mL－1及4-甲?；郊姿釣?0 μg·mL－1的系統(tǒng)適用性溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果表明主成分氨甲苯酸與雜質(zhì)4-甲?；郊姿徇_(dá)到良好分離，空白溶液不干擾主成分和雜質(zhì)的測定。
3.2 線性范圍與校正因子考察
精密稱取氨甲苯酸對照品適量，用流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度分別為1.10、4.40、5.50、11.1、44.0 和55.0 ng·mL－1的系列對照品溶液。精密稱取4-甲?；郊姿徇m量，用流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度分別為1.22、4.88、6.10、12.2、48.8 和61.0 ng·mL－1的系列對照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各雜質(zhì)的質(zhì)量濃度（C，ng·mL－1）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果線性方程氨甲苯酸為Y＝4855X－44.21，r＝1.000；4-甲酰基苯甲酸為Y＝1687X－330.5，r＝1.000。采用主成分與雜質(zhì)線性方程斜率比較法計(jì)算4-甲酰基苯甲酸的校正因子f＝2.88。
3.3 重復(fù)性試驗(yàn)
精密量取A 企業(yè)氨甲苯酸注射液1 mL 置25 mL 量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，4-甲?；郊姿岬暮縍SD為0.44%，表明方法重復(fù)性良好。
3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)
精密稱取4-甲?；郊姿釋φ掌?0.14、20.19 和30.37 mg，分別置250 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成50%、100%、150% 3 個(gè)濃度水平的對照品溶液，精密量取1 mL，置25 mL 量瓶中，各3 份。再精密量取B 企業(yè)氨甲苯酸注射液1 mL 置上述25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，4-甲酰基苯甲酸回收率為97.85 ～102.6%，RSD為1.4%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。
3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，于0、2、4、8 和10 h 分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果樣品中雜質(zhì)峰面積RSD為0.50%，表明4-甲?；郊姿嵩?0 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
3.6 4-甲?；郊姿岬臋z測限和定量限
分別以3 倍和10 倍信噪比（S/N）測定方法的檢測限和定量限，得4-甲?；郊姿釞z測限和定量限分別為0.27 ng·mL－1和1.07 ng·mL－1。
3.7 加校正因子的主成分自身對照法與外標(biāo)法比較
精密吸取“3.3”項(xiàng)下樣品溶液1 mL 置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，再精取1 mL 置20 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。
精密稱取4-甲酰基苯甲酸20.19 mg 置250 mL量瓶中，加甲醇10 mL 使之溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精取0.25 mL 置25 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。分別吸取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表1。加校正因子的主成分自身對照法與外標(biāo)法測定結(jié)果一致，可以采用加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算樣品中4-甲?；郊姿岬暮俊?/p>
表1 加校正因子的主成分自身對照法與外標(biāo)法測定結(jié)果Tab 1 Main component self-compare with orrection factor method and external standard method
3.8 樣品有關(guān)物質(zhì)測定
按有關(guān)物質(zhì)檢查方法，對9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)153批氨甲苯酸注射液的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行考察。結(jié)果表明5 個(gè)企業(yè)101 批樣品未檢出4-甲酰苯甲酸，2個(gè)企業(yè)38 批樣品中4-甲酰苯甲酸含量小于0.2%，2個(gè)企業(yè)14批樣品中4-甲酰苯甲酸含量大于0.2%。
4 討論
4.1 半制備色譜條件和色譜-質(zhì)譜條件的確定
為建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 方法對雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，本試驗(yàn)在WS1-（YH-002）-1995-2020 標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)色譜條件的基礎(chǔ)上，采用醋酸銨溶液代替了磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)相為20 mmol·L－1醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0）-甲醇（80∶20）時(shí)，基線穩(wěn)定，空白溶劑對于測定無干擾，并且在該流動(dòng)相下，在半制備液相中，氨甲苯酸與4-甲酰苯甲酸能達(dá)到良好分離，便于收集目標(biāo)雜質(zhì)。
4.2 有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)修訂
采用氨甲苯酸注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS1-（YH-002）-1995-2020 中有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)色譜條件對氨甲苯酸注射液中雜質(zhì)情況進(jìn)行深入研究，該方法優(yōu)于各企業(yè)現(xiàn)行注冊標(biāo)準(zhǔn)。在本項(xiàng)探索性研究中定性了氨甲苯酸注射液中雜質(zhì)4-甲酰基苯甲酸，紫外最大吸收波長為254 nm，在230 nm 的檢測波長下校正因子為2.88，因此需按加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算其含量。
結(jié)合樣品測定結(jié)果及ICH Q3B（R）關(guān)于日最大劑量在100 mg ～2 g 的制劑（本品為0.6 g）中雜質(zhì)的質(zhì)控限度[11]，擬定雜質(zhì)限度為0.2%。
4.3 雜質(zhì)4-甲?；郊姿岙a(chǎn)生機(jī)制
通過與氨甲苯酸原料藥有關(guān)物質(zhì)色譜圖比較，有的企業(yè)生產(chǎn)的注射液中4-甲?；郊姿岬暮窟h(yuǎn)遠(yuǎn)高于原料藥，氨甲苯酸注射液與氨甲苯酸原料中的4-甲酰基苯甲酸產(chǎn)生途徑不同，該雜質(zhì)在原料藥中來自對甲基苯甲酸氯化副產(chǎn)物，注射液中的4-甲?；郊姿峥赡芘c注射液生產(chǎn)工藝和在某種條件下（光、熱和氧的作用）的降解有關(guān)。推測其產(chǎn)生機(jī)制如圖6所示。
圖6 氨甲苯酸產(chǎn)生機(jī)制Fig 6 Production mechanism of aminomethylbenzoic acid
5 結(jié)論
本試驗(yàn)對氨甲苯酸注射液中的特定雜質(zhì)進(jìn)行研究，半制備柱從樣品中制備雜質(zhì)，建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 法對樣品中的雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定該雜質(zhì)為4-甲酰基苯甲酸，并對方法的有效性進(jìn)行了評價(jià)，計(jì)算出該雜質(zhì)的相對校正因子，對現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂，進(jìn)一步完善氨甲苯酸注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以對本品的安全性進(jìn)行全面評價(jià)，為氨甲苯酸注射液的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。
