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        對氨甲苯酸注射液中特定雜質(zhì)4-甲?;郊姿岬难芯?/h1>
        2021-05-06 07:35:58張耀文于明李沫孫苓苓遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心沈陽110036遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院沈陽110036
        中南藥學(xué) 2021年4期

        張耀文,于明,李沫,孫苓苓*(1.遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心,沈陽 110036;2.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院,沈陽 110036)

        氨甲苯酸(aminomethylbenzoic acid monohydrate),又稱止血芳酸,化學(xué)名為對氨甲基苯甲酸一水合物,分子式為C8H9NO2·H2O。氨甲苯酸是一種抗纖溶止血藥,國內(nèi)于1968年開始生產(chǎn)。氨甲苯酸臨床上主要用于原發(fā)性纖維蛋白過度溶解所引起的出血,包括急性和慢性、局限性或全身性的高纖溶出血的治療[1-2]。本次國家計(jì)劃抽驗(yàn)的品種氨甲苯酸注射液共抽樣153 批,執(zhí)行《中國藥典》1995年版二部標(biāo)準(zhǔn)和國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn),《中國藥典》2020年版和國外藥典均未收載。

        藥品中的有關(guān)物質(zhì)是否能得到合理、有效的控制,直接關(guān)系到其質(zhì)量的可控性與安全性。本次總計(jì)153 批次的氨甲苯酸注射液按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn),結(jié)果均符合規(guī)定,其中4 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的樣品(約占36%)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中無有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng),不能評價(jià)制劑中工藝雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的情況。目前國內(nèi)僅有少量文獻(xiàn)對氨甲苯酸注射液的有關(guān)物質(zhì)測定方法進(jìn)行研究[3-6],未有文獻(xiàn)針對氨甲苯酸中的雜質(zhì)進(jìn)行過定性鑒別及定量測定。超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)(UHPLC-Q Exactive Focus MS)結(jié)合了超高效液相色譜的高分離能力和高分辨質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性、高分辨率等檢測優(yōu)勢,可獲得豐富有效的化合物多級質(zhì)譜、精確相對分子質(zhì)量等信息,保證了結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[7-10]。本試驗(yàn)采用2020年3月頒布的氨甲苯酸注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS1-(YH-002)-1995-2020 中的色譜條件,對153 批樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查,利用半制備柱從樣品中制備雜質(zhì),并建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 方法對雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及定量分析,進(jìn)一步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),以期對本品的安全性進(jìn)行全面評價(jià)。

        1 儀器與試藥

        Waters e2695 液相色譜儀、Waters 2487 液相色譜儀、Waters 2998 UVD 檢測器(美國Waters 公司);BUCHI R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi 公司);Vanquish 超高效液相色譜儀、四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀、結(jié)構(gòu)解析軟件Mass Frontier(美國Thermo公 司);XP205型電子分析天平、S400 Seven excellent 型pH 計(jì)(瑞士Mettler-Toledo 公司);小分子未知物定性軟件Compound Discoverer(美國Thermo 公司)。

        氨甲苯酸注射液為國家評價(jià)性抽驗(yàn)樣品,共153 批,涉及9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè);4-甲?;郊姿幔ㄅ?hào):MKLB 3894V,SIGMA-ALDRICH,純度:98.5%);氨甲苯酸對照品(批號(hào):100921-201702,中國食品藥品檢定研究院,純度:97.8%);氨甲苯酸原料藥(湖南洞庭藥業(yè),純度:99.9%,批號(hào):W1903010),乙腈為色譜純,其他試劑為分析純,水為超純水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 有關(guān)物質(zhì)的檢測與制備

        2.1.1 有關(guān)物質(zhì)色譜條件 色譜柱:ZORBAX SB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉11.0 g,辛烷磺酸鈉1.0 g,加水800 mL 使溶解,用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.52,加水至900 mL)-乙腈(88∶12);柱溫:40 ℃;流速:1 mL·min-1;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測波長:230 nm。

        2.1.2 有關(guān)物質(zhì)溶液的配制 精密量取氨甲苯酸注射液樣品1 mL 置25 mL 量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。精密稱取氨甲苯酸原料藥10 mg 置25 mL 量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得供試品溶液。

        2.1.3 有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果及分析 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定,氨甲苯酸注射液及原料藥典型圖譜見圖1。

        圖1 氨甲苯酸注射液(A、B)和原料藥(C)色譜圖Fig 1 Chromatogram of aminomethylbenzoic acid injection sample(A、B)and API(C)

        在A 企業(yè)氨甲苯酸注射液有關(guān)物質(zhì)色譜圖中,與主成分峰相對保留時(shí)間約為1.83 的雜質(zhì)峰1 峰面積大于對照溶液主峰面積(0.1%),超出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最大單個(gè)雜質(zhì)限度。該雜質(zhì)的PDA 光譜圖顯示,其紫外最大吸收波長為254 nm,在230 nm 檢測時(shí),該雜質(zhì)被低估,見圖2。通過與原料藥色譜圖對比,發(fā)現(xiàn)氨甲苯酸注射液色譜圖中該雜質(zhì)的含量高于原料藥,為注射液中特定的雜質(zhì)。

        圖2 氨甲苯酸峰與雜質(zhì)峰1 光譜圖Fig 2 Spectra of aminomethylbenzoic acid and impurity 1

        2.1.4 半制備色譜條件 半制備色譜柱:Diamonsil C18(2)(250 mm×10.0 mm,5 μm);流動(dòng)相:20 mmol·L-1醋酸銨溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0)-甲醇(80∶20);柱溫:35℃;流速:2 mL·min-1;進(jìn)樣體積:1 mL;檢測波長:254 nm。

        2.1.5 有關(guān)物質(zhì)的制備 取A 企業(yè)樣品,精密吸取1 mL,注入色譜儀,按“2.1.4”項(xiàng)下方法測定,收集目標(biāo)流份,置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑,用少量乙醇轉(zhuǎn)移至小瓶中,重結(jié)晶,即得。

        2.2 LC-MS 定性鑒別

        2.2.1 LC-MS 色譜條件 色譜柱:Thermo Acclaim 120 C18(4.6 mm×150 mm,3 μm); 流動(dòng)相:20 mmol·L-1醋酸銨溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0)-甲醇(80∶20);柱溫:35℃;流速:0.5 mL·min-1;進(jìn)樣體積:2 μL;檢測波長:254 nm。

        噴霧電壓:3500 V,霧化溫度:350℃,鞘氣壓力:45 arb,輔助氣壓力:15 arb,離子傳輸管溫度:320℃,掃描模式:Full Scan-ddms2,掃描范圍:m/z75 ~750,分辨率:70 000 ~17 500。

        2.2.2 LC-MS 定性鑒別結(jié)果 利用UHPLC-Q Exactive Focus MS 對雜質(zhì)的一、二級質(zhì)譜圖進(jìn)行分析,確定化合物及二級碎片裂解規(guī)律。

        一級質(zhì)譜圖給出分子離子峰m/z149.02442,二級質(zhì)譜可見兩個(gè)碎片離子峰(m/z105.03459和m/z121.02950),運(yùn)用Mass Frontier 軟件輔助Compound Discoverer 軟件,對該化合物的碎片結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸屬,推測該雜質(zhì)為4-甲酰基苯甲酸。質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖3~4。

        圖3 4-甲?;郊姿犭x子流圖和質(zhì)譜圖Fig 3 EIC and mass spectrum of 4-formylbenzoic acid

        圖4 4-甲?;郊姿崴槠呀馔緩紽ig 4 Fragmentation pathway of 4-formylbenzoic acid

        2.3 4-甲酰基苯甲酸的結(jié)構(gòu)確定

        按“2.1.5”項(xiàng)下方法半制備獲得的目標(biāo)雜質(zhì)與4-甲?;郊姿釋φ掌芬合嗌V一致,確定該雜質(zhì)為4-甲?;郊姿幔ㄒ妶D5)。

        測定不同比例反應(yīng)后的納米顆粒以及反應(yīng)前脂質(zhì)體Zeta電位,重復(fù)測三次;動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(DLS)測定脂質(zhì)體粒徑;透射電鏡(TEM)觀察脂質(zhì)體形態(tài),取陽離子脂質(zhì)體質(zhì)量:siRNA質(zhì)量為5:1的樣品組,直接滴加在銅網(wǎng)上,靜置空氣中干燥30 min后測試。

        圖5 4-甲酰基苯甲酸對照品(A)和制備雜質(zhì)樣品(B)色譜圖Fig 5 HPLC chromatogram of 4-formyl benzoic acid standard(A)and prepared impurity(B)

        3 方法學(xué)驗(yàn)證

        3.1 專屬性

        精密稱取氨甲苯酸對照品和4-甲?;郊姿釋φ掌愤m量,加流動(dòng)相制成含氨甲苯酸為20 μg·mL-1及4-甲?;郊姿釣?0 μg·mL-1的系統(tǒng)適用性溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,結(jié)果表明主成分氨甲苯酸與雜質(zhì)4-甲?;郊姿徇_(dá)到良好分離,空白溶液不干擾主成分和雜質(zhì)的測定。

        3.2 線性范圍與校正因子考察

        精密稱取氨甲苯酸對照品適量,用流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度分別為1.10、4.40、5.50、11.1、44.0 和55.0 ng·mL-1的系列對照品溶液。精密稱取4-甲?;郊姿徇m量,用流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度分別為1.22、4.88、6.10、12.2、48.8 和61.0 ng·mL-1的系列對照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積。以各雜質(zhì)的質(zhì)量濃度(C,ng·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果線性方程氨甲苯酸為Y=4855X-44.21,r=1.000;4-甲酰基苯甲酸為Y=1687X-330.5,r=1.000。采用主成分與雜質(zhì)線性方程斜率比較法計(jì)算4-甲酰基苯甲酸的校正因子f=2.88。

        3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

        精密量取A 企業(yè)氨甲苯酸注射液1 mL 置25 mL 量瓶中,按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份,按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析,4-甲?;郊姿岬暮縍SD為0.44%,表明方法重復(fù)性良好。

        3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

        精密稱取4-甲?;郊姿釋φ掌?0.14、20.19 和30.37 mg,分別置250 mL量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成50%、100%、150% 3 個(gè)濃度水平的對照品溶液,精密量取1 mL,置25 mL 量瓶中,各3 份。再精密量取B 企業(yè)氨甲苯酸注射液1 mL 置上述25 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。

        按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析,計(jì)算回收率,4-甲酰基苯甲酸回收率為97.85 ~102.6%,RSD為1.4%,表明本方法準(zhǔn)確度良好。

        3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取樣品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件,于0、2、4、8 和10 h 分別進(jìn)樣測定,記錄峰面積。結(jié)果樣品中雜質(zhì)峰面積RSD為0.50%,表明4-甲?;郊姿嵩?0 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        3.6 4-甲?;郊姿岬臋z測限和定量限

        分別以3 倍和10 倍信噪比(S/N)測定方法的檢測限和定量限,得4-甲?;郊姿釞z測限和定量限分別為0.27 ng·mL-1和1.07 ng·mL-1。

        3.7 加校正因子的主成分自身對照法與外標(biāo)法比較

        精密吸取“3.3”項(xiàng)下樣品溶液1 mL 置50 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,再精取1 mL 置20 mL 量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。

        精密稱取4-甲酰基苯甲酸20.19 mg 置250 mL量瓶中,加甲醇10 mL 使之溶解,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,精取0.25 mL 置25 mL 量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液。分別吸取20 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖,結(jié)果見表1。加校正因子的主成分自身對照法與外標(biāo)法測定結(jié)果一致,可以采用加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算樣品中4-甲?;郊姿岬暮俊?/p>

        表1 加校正因子的主成分自身對照法與外標(biāo)法測定結(jié)果Tab 1 Main component self-compare with orrection factor method and external standard method

        3.8 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

        按有關(guān)物質(zhì)檢查方法,對9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)153批氨甲苯酸注射液的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行考察。結(jié)果表明5 個(gè)企業(yè)101 批樣品未檢出4-甲酰苯甲酸,2個(gè)企業(yè)38 批樣品中4-甲酰苯甲酸含量小于0.2%,2個(gè)企業(yè)14批樣品中4-甲酰苯甲酸含量大于0.2%。

        4 討論

        4.1 半制備色譜條件和色譜-質(zhì)譜條件的確定

        為建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 方法對雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,本試驗(yàn)在WS1-(YH-002)-1995-2020 標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)色譜條件的基礎(chǔ)上,采用醋酸銨溶液代替了磷酸鹽緩沖液,流動(dòng)相為20 mmol·L-1醋酸銨溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0)-甲醇(80∶20)時(shí),基線穩(wěn)定,空白溶劑對于測定無干擾,并且在該流動(dòng)相下,在半制備液相中,氨甲苯酸與4-甲酰苯甲酸能達(dá)到良好分離,便于收集目標(biāo)雜質(zhì)。

        4.2 有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)修訂

        采用氨甲苯酸注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS1-(YH-002)-1995-2020 中有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)色譜條件對氨甲苯酸注射液中雜質(zhì)情況進(jìn)行深入研究,該方法優(yōu)于各企業(yè)現(xiàn)行注冊標(biāo)準(zhǔn)。在本項(xiàng)探索性研究中定性了氨甲苯酸注射液中雜質(zhì)4-甲酰基苯甲酸,紫外最大吸收波長為254 nm,在230 nm 的檢測波長下校正因子為2.88,因此需按加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算其含量。

        結(jié)合樣品測定結(jié)果及ICH Q3B(R)關(guān)于日最大劑量在100 mg ~2 g 的制劑(本品為0.6 g)中雜質(zhì)的質(zhì)控限度[11],擬定雜質(zhì)限度為0.2%。

        4.3 雜質(zhì)4-甲?;郊姿岙a(chǎn)生機(jī)制

        通過與氨甲苯酸原料藥有關(guān)物質(zhì)色譜圖比較,有的企業(yè)生產(chǎn)的注射液中4-甲?;郊姿岬暮窟h(yuǎn)遠(yuǎn)高于原料藥,氨甲苯酸注射液與氨甲苯酸原料中的4-甲酰基苯甲酸產(chǎn)生途徑不同,該雜質(zhì)在原料藥中來自對甲基苯甲酸氯化副產(chǎn)物,注射液中的4-甲?;郊姿峥赡芘c注射液生產(chǎn)工藝和在某種條件下(光、熱和氧的作用)的降解有關(guān)。推測其產(chǎn)生機(jī)制如圖6所示。

        圖6 氨甲苯酸產(chǎn)生機(jī)制Fig 6 Production mechanism of aminomethylbenzoic acid

        5 結(jié)論

        本試驗(yàn)對氨甲苯酸注射液中的特定雜質(zhì)進(jìn)行研究,半制備柱從樣品中制備雜質(zhì),建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 法對樣品中的雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,確定該雜質(zhì)為4-甲酰基苯甲酸,并對方法的有效性進(jìn)行了評價(jià),計(jì)算出該雜質(zhì)的相對校正因子,對現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂,進(jìn)一步完善氨甲苯酸注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),以對本品的安全性進(jìn)行全面評價(jià),為氨甲苯酸注射液的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

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